Исследование микроорганизмов в нативном состоянии.

Вспомогательные материалы по теме.

В живом состоянии микроорганизмы исследуют с целью выявления их формы, подвижности или определения прижизненной внутренней структуры. Изучают нативные и окрашенные препараты, используя методы " раздавленной" или " висячей" капли.

Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0, 001% раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат " раздавленная" или " висячая" капля и микроскопируют его.

Приготовление препарата " раздавленная" капля. На центр обезжиренного предметного стекла наносят каплю жидкой бульонной культуры. Если культура выращивалась на плотной питательной среде, то на стекло наносят каплю стерильного изотонического раствора натрия хлорида, затем петлей прикасаются к культуре и приставшие к ней бактерии размешивают в приготовленной капле. Можно заранее приготовить взвесь микроорганизмов в изотоническом растворе и взять каплю из нее. На исследуемый материал накладывают покровное стекло так, чтобы не было пузырьков воздуха. Каплю надо брать такой величины, чтобы она заполняла все пространство между покровным и предметным стеклами и не выступала за края покровного. Препарат можно рассматривать как с сухими системами, так и с иммерсионной. Микроскопируют, используя объективы 40х или 90х. Очень хорошие результаты получают, применяя темнопольное или фазово-контрастное устройство. Препараты быстро высыхают, поэтому, если, их приходится рассматривать не тотчас, а спустя некоторое время, их помещают во влажную камеру (чашку Петри), на дно которой положено 2-3 влажных кружка фильтровальной бумаги, покрытых двумя сухими. Во избежание высыхания препарата и вызываемого конвекцией турбулентного движения жидкости подобные препараты можно герметизировать. Для этой цели следует пользоваться парафиновым маслом, смесью равных частей парафина и вазелина или лаком для ногтей.

В центре влажного препарата быстро возникает недостаточность кислорода. В сущности именно это помогло Пастеру открыть анаэробный обмен: наблюдая за препаратом, он заметил, что облигатные анаэробы сохраняли подвижность только в центре, но не по краям.

Подвижные микроорганизмы иногда могут адсорбироваться на стекле; в таких случаях подвижность легче наблюдать в " висячей" капле.

Приготовление препарата " висячая" капля. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю бактериальной взвеси. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки, в результате чего стекла склеиваются. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. Получается герметически закрытая камера, в которой капля долго не высыхает. В правильно приготовленном препарате капля свободно висит над лункой, не касаясь ее дна или края. Микроскопируют со стороны покровного стекла, причем вначале следует найти край на малом увеличении и при суженной диафрагме, используя сухой объектив 8х, затем на большом и продолжить наблюдение (рис.3).

При изучении подвижности микроорганизмов необходимо отличать истинную подвижность от броуновского движения, которое является следствием ударов о бактерии движущихся в растворе молекул и выявляется в виде колебаний. Многие подвижные микроорганизмы движутся очень быстро, что затрудняет точное наблюдение. Добавляя к суспензии микроорганизмов метилцеллюлозу, можно уменьшить скорость их движения и создать условия, при которых движение жгутиков становится видимым.

Недостатком метода является наличие ряда оптических дефектов, связанных с кривизной лунки, что препятствует получению высококачественных мнкрофотографий, а также невозможность использования темнопольного и фазово-контрастного устройств из-за большой толщины предметных стекол с лунками.