Стадия ТП-1. Выращивание посевного материала в колбах

1.1. Характеристика штамма-продуцента лакказы.

В качестве продуцента фермента лакказы используют культуру высшего базидиального гриба Trametes hirsuta 56 (Wulfen.) Pilá t.

Штамм-продуцент характеризуется высокой скоростью роста и активным синтезом экстрацеллюлярной лакказы в условиях жидкофазного глубинного культивирования.

На твердой сусло-агаризованной среде образует колонии с хорошо развитым шерстисто-волокнистым воздушным мицелием. Зональность колоний не выражена. На 3-и сутки выращивания при температуре 32^оС диаметр колонии становится равен 6-7 см. Воздушный мицелий белого цвета. Край колонии гладкий, приподнятый. Реверзум неизмененный, затем побелевший. При старении колонии с желтоватым или кремоватым оттенком, образуют зачатки плодовых тел в виде бугорков 3-10 мм в диаметре. Запах приятный грибной.

В глубинной культуре мицелиальные агломераты опушенные сферической или неправильной формы диаметром от 1 до 8 мм. В глубинной и поверхностной культуре, как правило, не образует хламидоспоры, артроспоры и оидии. Гифы септированные, разветвленные под прямым углом. Гифы могут образовывать вздутия и утолщения на концах. Гифы трех типов, в глубинной культуре преимущественно двух типов: тонкие (1, 0-2, 0 мкм) и толстые (2, 5-5, 0 мкм). Пряжки одиночные, большие, крутоизогнутые, чаще без просвета, иногда медальонные.

Аэроб. Оптимальная температура выращивания (31±1)^оС, оптимальное значение рН 4, 0.

1.2. Приготовление питательной среды.

Питательная среда, г/л:

Кукурузный экстракт развести отдельно (100 г/л) и простерилизовать отдельно при 0, 18 МПа в течение 40 минут.

Муку развести в отдельной емкости в небольшом количестве холодной воды, влить в кипящую воду при интенсивном перемешивании, выдержать 10 минут, добавить соли и стерильный кукурузный экстракт. Охладить до 30^оС. Довести рН до 5, 7 путем титрования 10 % Н₂SO₄ или 10 % КОН.

Приготовленную среду разливают по 150 мл в качалочные колбы вместимостью 750 мл и закрывают пробками с бумажными колпачками.

1.3. Стерилизация питательной среды.

Приготовленные колбы с питательной средой помещают в автоклав, стерилизуют при давлении 0, 18 МПа в течение 40 мин, затем охлаждают до температуры (31±1)^оС и используют в течение месяца. Хранят при комнатной температуре.

1.4. Засев и выращивание посевного материала в колбах.

Все работы с пересевом культуры и отбором проб производят в боксе в стерильных условиях в зоне пламени.

Получение посевного материала в колбах проводят в несколько этапов (пассажей):

- первый пассаж – пересев культуры с твердой питательной средой (косяка) проводят из расчета 1 косяк на 1 качалочную колбу путем переноса культуры вместе с кусочком агаризованной среды с помощью прокаленного микробиологического крючка.

- последующие пассажи (второй, третий и т.д.) проводят из расчета 10% объемных посевного материала с предыдущего пассажа (на 150 см³ питательной среды 15 см³ культуральной жидкости предыдущего пассажа) методом переноса посевного материала с помощью стерильной пипетки Мора с расширенным концом или с помощью стерильного цилиндра.

Для засева посевного инокулятора требуется подготовить 0, 44 л посевного материала третьего и последующих пассажей. Срок хранения посевного материала 10 дней. Хранят посевной материал в холодильнике при температуре +4^оС.

Засеянную колбу закрывают стерильной ватной пробкой, помещают на качалку в термостатируемую комнату и выращивают в следующем режиме:

- температура 30-32^оС

- частота вращения качалки 200 об/мин (180-240 об/мин)

- время выращивания: первый пассаж – 3-4 суток (72-96 час.)

второй - 2-3 сут. (48-72 час.)

третий и последующие - 2-3 сут. (48-72 час.)

Посевной материал контролируется (из расчета 10% посевных колб):

- на отсутствие посторонней микрофлоры путем высева на мясо-пептонный агар;

- на оксидазную активность спектрофотометрически;

- по морфолого-физиологическим показателям путем микроскопирования выращенного посевного материала (согласно п. 1.1.).

В качестве производственного посевного материала используется культуральная суспензия после 3-го и последующих пассажей (до 10).

Поддержание культуры на твердой питательной среде и выращивание в колбах проводят согласно инструкции.

Готовый посевной материал в колбах используется для засева среды в инокуляторе (поз. ФО-10) на стадии ТП-2.

Некондиционный посевной материал направляется на стадию ОБО-1.