Рестриктная реакция

Рестриктазы и их классификация. Рестриктная реакция – это специфическое расщепление двуцепочечной ДНК в определенном участке под действием ферментов рестриктаз (эндонуклеаз рестрикции, рестрикционные эндонуклеазы). В природе рестриктазы локализованы в бактериальной клетке и являются частью внутриклеточного защитного механизма, обеспечивающего расщепление чужеродной (например, вирусной) ДНК. Вместе с тем, родственная бактериальная ДНК остается нечувствительной к их действию, так как внутри клетки она подвергается метилированию под действием ферментов метилаз. По типу узнаваемой последовательности ДНК и ассоциированным с ферментами кофакторами выделяют три класса рестриктаз. В генной инженерии в основном используют рестриктазы II класса. Сайт узнавания таких рестриктаз (рестриктный сайт) представляет собой палиндромную (зеркально симметричную) последовательность длиной 6 – 12 пар оснований, а необходимым кофактором для их активности являются ионы Mg²⁺. По типу образуемых при рестриктной реакции концов рестриктазы II класса можно разделить на две большие группы: рестриктазы, образующие «липкие» концы (sticky ends) и рестриктазы, образующие «тупые» концы (blunt ends). В свою очередь, рестриктазы, образующие «липкие» концы, разделяют на 3'-«выступающие» и 5’-«выступающие». Некоторые рестриктазы могут распознавать одну и ту же палиндромную последовательность, такие рестриктазы называют изошизомерами. Кроме этого, при расщепление ДНК некоторыми рестриктазами, узнающими различные палиндромы, может приводить к образованию одинаковых «выступающих» концов.

Условия проведения рестриктной реакции. Как правило, каждая рестрикционная эндонуклеаза продается коммерческими компаниями в сопровождении реакционного буфера, в котором активность фермента максимальна. Большинство коммерческих компаний разработало 4-5 буферных растворов, подходящих для работы практически всех основных рестриктаз. Буферные растворы для проведения рестриктной реакции созданы на основе трис-HCl pH 7.5 – 8.5, в их состав также входят ионы магния и BSA для стабилизации структуры фермента. Однако, они отличаются по концентрации добавленных солей в них солей, т.е. бывают высокосолевыми и низкосолевыми. Для многих рестриктаз требуется дополнительное добавление BSA в реакционную смесь в концентрации 100 мкг/мл, а активность некоторых невозможна в отсутствие S-аденозилметионина (SAM). Если для проведения рестриктной реакции использовать неподходящий буфер, то в случае некоторых рестриктаз наблюдается такое явление, как расщепление ДНК по неспецифическим участкам (star activity). Проводя рестриктную реакцию, следует хранить все реагенты на льду, а добавки вносить стерильными носиками. Температурный оптимум большинства рестриктаз составляет 37 С. Оптимальное соотношение фермент/ДНК в рестриктной реакции составляет примерно 2 единицы фермента на 1 мкг ДНК, а длительность проведения рестриктной реакции может варьировать от 2.5 до 15 часов. После проведения реакции многим рестриктазам требуется тепловая инактивация, которую обычно проводят при 65 С в течение 20 минут. Полноту прохождения рестриктной реакции анализируют с помощью метода горизонтального электрофореза в агарозном геле. Полностью рестрицированный фрагмент обычно выглядит на геле, как линеаризованная единичная полоса. Если же над и под этой полосой заметны, более слабые полосы, которые мигрируют на уровне релаксированной, скрученной и суперскрученной изоформ кольцевой ДНК, можно говорить о недорестрикции.

Очень часто исследователю требуется проводить рестриктную реакцию одновременно двумя рестриктазами. Для этих целей коммерческими компаниями были разработаны таблицы, где указан подходящий буфер для проведения рестриктной реакции практически любыми двумя рестриктазами. В исключительных случаях, когда это невозможно, нужно провести рестриктную реакцию сначала одной рестриктазой в подходящем буфере, затем очистить полученный фрагмент ДНК и провести рестриктную реакцию второй рестриктазой в другом буфере.

Критерии выбора рестриктаз при клонировании При выборе рестриктаз для клонирования следует руководствоваться следующими соображениями.

o рестриктазы должны быть разными

o сайты рестрикции этих эндонуклеаз должны быть уникальными, т.е. нуклеотидные последовательности вектора и вставки не должны иметь более одного сайта каждой из этих рестриктаз

o выбирать преимущественно те рестриктазы, сайты рестрикции которых находятся в участке множественного клонирования вектора

o в случае клонирования гена в экспрессионный вектор, 5' рестриктаза (фланкирующая ген с 5’ конца) должна быть NdeI или NcoI. Дело в том, что участки узнавания рестриктаз NdeI или NcoI содержат в себе старт-кодон ATG, и в большинстве векторов участок одной из этих рестриктаз является первым в сайте множественного клонирования. Такое положение старт-кодона является оптимальным относительно промотора, что позволяет получить высокие уровни экспрессии.

o стараться выбирать рестриктазы, при расщеплении ДНК, которыми образуются «липкие» концы. Это связано с тем, что лигирование по «липким» концам проходит в среднем в 50 раз эффективнее, чем по «тупым» (см. ниже).

При встраивании гена в плазмиду возможны следующие ситуации:

Переклонирование. В случае переклонирования исследователю требуется просто переклонировать ген из одной плазмиды в другую. Если ген был встроен в плазмиду по сайтам рестрикции, которые есть в том векторе, куда планируется переклонировать ген, требуется провести двойную рестрикцию обеих плазмид, экстрагировать рестрицированные ген и вектор из геля и провести лигазную реакцию. Аналогичным образом следует действовать и в том случае, если при рестрикции двух плазмид разными рестриктазами образуются одинаковые «торчащие» концы.

Следует также обратить внимание на то, что некоторые рестриктазы образуют «совместимые» друг с другом концы, например, фрагмент, несущий липкий конец после рестрикции ферментом XhoI, будет лигироватся с фрагментом после рестрикции ферментом SalI. Другие примеры – NheI и XbaI, BamHI и BglII (рис. 6).

BamHI G’ GATCC A’ GATCT BglII

C CTAG’G T CTAG’A

XhoI C’TCGAG G’TCGAC SalI

G AGCT’C C AGCT’G

NheI G’CTAGC T’CTAGA XbaI

C GATC’G AGATC’T

Рис.6. Примеры сайтов узнавания рестриктаз, образующих совместимые концы.

Клонирование ПЦР-продуктов. Если же сайты рестрикции в плазмиде, куда встроен ген, и в векторе, куда его планируется встроить, различаются, необходимо амплифицировать ген методом ПЦР со специфическими праймерами, в состав которых входят рестриктные сайты, содержащиеся в векторе. В этом случае при дизайне праймеров для ПЦР в последовательность праймера до его комплементарной части следует включить сайт узнавания рестриктаз, а также несколько нуклеотидов до него, которые необходимы для посадки фермента и эффективной рестрикции. Следует заметить, что число нуклеотидов, которые неоходимо включить в праймер до сайтов рестрикции для каждой рестриктазы разное (от 2 до 7). Соответствующая информация есть на веб-сайте любой коммерческой компании, которая продает рестрикционные эндонуклеазы. Аналогичным образом следует поступать, если последовательности гена нет и ее необходимо амплифицировать для клонирования, используя в качестве матриц кДНК, полученную методом обратной транскрипции мРНК, или библиотеку синтезированных кДНК фрагментов.

ПЦР фрагмент, полученный амплификацией с помощью Tag полимеразы, можно также клонировать в так называемые «Т векторы».

Особенности клонирования по двум рестриктным сайтам.

Для успешного клонирования вставки необходима тщательная подготовка вектора. С помощью аналитической рестрикции (по каждой рестриктазе отдельно) желательно предварительно убедиться, что рестрикция молекулы ДНК под действием обеих эндонуклеаз проходит ПОЛНОСТЬЮ. Если вектор обработан хотя бы одной рестриктазой не полностью, то последующее легирование со вставкой (бимолекулярная реакция) будет идти крайне неэффективно, и вектор будет лигироваться сам на себя по второй рестриктазе (более выгодная мономолекулярная реакция). В случае, если не удается добиться эффективного расщепления вектора обеими рестриктазами, следует применить один из приемов: 1) дефосфорилирование обработанного обеими рестриктазами вектора 2) рестрикция вектора дополнительной (третьей) рестриктазой, лежащей между первыми двумя. Второй прием возможен при наличии и удобстве использования такой рестриктазы.