Общая характеристика ингредиентов РСК.

ИССЛЕДУЕМАЯ СЫВОРОТКА перед постановкой реакции прогревается на водяной бане 30 мин для инактивации ее собственного комплемента и разводится начиная с 1: 5.

АНТИГЕНОМ могут быть культуры бактерий, их лизаты, вирусы и вирус–содержащие материалы, экстракты патологически измененных органов и тканевые липиды.

КОМПЛЕМЕНТ – сыворотка морских свинок, полученная в день опыта. В настоящее время используется производственный сухой комплемент.

ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА состоит из смешанных в равных объемах гемолитической сыворотки и 3% взвеси эритроцитов барана по осадку. Для сенсибилизации эритроцитов гемолизинами смесь выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин.

Постановка основного опыта РСК. В 1 пробирку вносят СЫВОРОТКУ, АНТИГЕН И КОМПЛЕМЕНТ, во вторую – сыворотку, комплемент и вместо антигена изотонический раствор натрия хлорида (КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ), в третью – антиген, комплемент и тот же раствор натрия хлорида (КОНТРОЛЬ АНТИГЕНА). Пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 1ч. Одновременно готовят гемолитическую систему, которую затем добавляют во все три пробирки после извлечения штатива из термостата. Смешав гемсистему с ингредиентами трех пробирок, последние вновь ставят в термостат на 1 ч, и спустя это время учитывают результаты РСК.

При учете РСК интенсивность реакции обозначается плюсами: «++++»– резко положительная реакция с полной задержкой гемолиза, жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты осели на дно; «+++», «++» –положительная реакция, отличается нарастанием окраски жидкости вследствие гемолиза и уменьшения количества эритроцитов в осадке; «+» – слабоположительная реакция, жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки незначительное количество эритроцитов. Отрицательная реакция обозначается знаком «–», при этом наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет интенсивно–розовую окраску («лаковая кровь»).

РСК – весьма сложная, но очень чувствительная специфическая реакция. Широко применяется в диагностике сифилиса, хронической формы гонореи, коклюша, актиномикоза, всех риккетсиозов и вирусных инфекций.

25. Реакция нейтрализации (реакция нейтрализации токсина антитоксином; реакция вирусной нейтрализации на животных, эмбрионах и клеточных культурах. Механизм и практическое использование).

Идентифицировать вирус по характеру его действия на монослой культуры клеток, которые он разрушает или вызывает в них разного рода структурные изменения, очень трудно, и поэтому прибегают к постановке реакции нейтрализации (РН) вирусов заведомо известными вируснейтрализующими сыворотками. С этой целью полученный от больного вирус накапливают в культуре клеток и различные его разведения смешивают с неразведенной противовирусной сывороткой или, наоборот, постоянную дозу вируса добавляют к различным разведениям иммунной сыворотки. Смеси инкубируют в термостате. После этого смесями вируса и сыворотки заражают культуру клеток и о нейтрализующей силе ее антител судят по отсутствию цитопатического действия на клетки Смесью вирусов и сывороток можно заражать куриные эмбрионы или чувствительных животных. В таких случаях нейтрализующую активность антител определяют по предотвращению развития патологических изменений на хорионаллантоисной оболочке; нейтрализации вирусных гемагглютининов в жидкостях эмбриона, устранению летального действия вируса на животных

Подобным образом с помощью РН идентифицируются вирусы, выделенные из материала больных при заражении им куриных эмбрионов и животных. В таких случаях к вируснейтрализующим сывороткам прибавляют вируссодержащие жидкости эмбрионов и взвеси пораженных органов животных. После определенного времени инкубации смесями инфицируют культуры клеток, куриные эмбрионы и животных.

В серодиагностике вирусных инфекций РН определяют вирус–нейтрализующие антитела в сыворотке больных по известному вирусу. Ставят ее в динамике с парными сыворотками, одну из которых берут в разгаре заболевания, а вторую – спустя 2–3 недели, и по четырехкратному нарастанию титра антител в этой последней подтверждают диагноз.

26. Иммуноферментный анализ. Механизм и практическое использование.

Метод был разработан в начале 70-х гг независимо друг от друга тремя группами учёных. Метод напоминает РИА, но в его основу положено маркирование Аг или Ат, вступающего в реакцию, ферментом. Взд метки с субстратом обычно сопровождается изменением окраски среды. В настоящее время созданы многочисленные модификации этого метода, но наибольшее распространение получил гетерогенный ИФА на твёрдой фазе (твердофазный). Различают:

ПРЯМОЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА. В этом случае:

сыворотку с Ат инкубируют с Аг, фиксированным на твёрдом субстрате (чаще всего это пластиковая микропланшетка).

Ат, не связавшие Аг, удаляют многократным промыванием.

Вносят меченную ферментом сыворотку к Ат, связавшим Аг.

Определяют ко-во фермента–маркёра, связавшегося с Ат.

КОНКУРЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА.

Вносят сыворотку. Если в ней есть специфические Ат, то они связываются с Аг, фиксированном на твёрдом субстрате. Если специфических Ат нет, то Аг оказывается не связанным.

При добавлении специфических к фиксированному Аг Антител в первом случае им будет не с чем взаимодействовать (большинство Аг уже связаны) Þ содержание маркёра низкое. Во втором случае специфические Ат будут связываться с Аг и при отмывании они не будут смываться Þ высокое содержание маркёра.

Аналогично м.б. фиксированы АНТИТЕЛА, и различные фирмы выпускают именно планшеты с уже фиксированными Ат.

По сравнению с классическими методами выявления Аг этот метод позволяет непосредственно регистрировать их взаимодействие с Ат, а не вторичные проявления (агглютинацию, преципитацию или гемолиз). Метод очень ЧУВСТВИТЕЛЕН (достаточно концентрации 1нг/мл).

Определяют: Хламидии, клостридии, ВИЧ и др.

27. Реакция торможения гемагглютинации. Механизм и практическое использование.

Многие вирусы обладают способностью агглютинировать эритроциты строго определенных видов млекопитающих и птиц. Так, вирусы гриппа и эпидемического паротита агглютинируют эритроциты кур, морских свинок, человека, а аденовирусы – эритроциты крыс, мышей. В связи с этим для их обнаружения в материале больных или культурах клеток, эмбрионов и животных ставят реакцию гемагглютинации (РГА). Для этого в лунках планшетов готовят двукратно возрастающие разведения вируссодержащих материалов и жидкостей, добавляя к ним отмытые изотоническим раствором взвеси NaCl эритроцитов. Для контроля спонтанной агглютинации эритроциты смешивают ещё с равным объемом изотонического раствора NaCl. Смеси инкубируют в термостате при температуре 37°С или при комнатной температуре.

Результаты РГА учитывают по характеру агглютинации эритроцитов через 30–60 мин, когда они обычно полностью осаждаются в контроле. Положительная реакция обозначается плюсами. «++++» –осадок в виде «зонтика», «+++» – осадок с просветами, «++» – осадок с большими просветами, «+» –хлопьевидный осадок, окруженный зоной скомкованных эритроцитов, и «–» – такой же резко очерченный осадок эритроцитов в виде «пуговицы», как и в контроле

Являясь группоспецифической, РГА не дает возможности определить видовую принадлежность вирусов. Их идентифицируют с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Для ее постановки используют заведомо известные иммунные противовирусные сыворотки, которые в двукратно снижающихся концентрациях разводят в изотоническом растворе натрия хлорида и разливают по лункам. К каждому их разведению добавляют равное количество вируссодержащей жидкости. Контролем является взвесь вируса в изотоническом растворе натрия хлорида. Планшеты со смесью сывороток и вируса выдерживают в термостате 30 мин или при комнатной температуре 2 ч, затем в каждую из них добавляют взвесь эритроцитов. Спустя 30 мин определяют титр вируснейтрализующей сыворотки (т.е. максимальное ее разведение), вызвавшей задержку агглютинации эритроцитов.

Используют РТГА в серологической диагностике вирусных болезней, в частности гриппа и аденовирусных инфекций. Ставить ее лучше так же, как и РН, с парными сыворотками. Четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке подтверждает предполагаемый диагноз

28. Реакции фагоцитоза. Практическое использование реакции фагоцитоза при оценке иммунного статуса.

Фагоцитоз осущ-ся микрофагами и макрофагами. Стадии фагоцитоза: приближение, прилипание, погружение, переваривание.

Оценка функциональной активности фагоцитирующих клеток.

Колич. оценку фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов производят в цельной крови, в лейкоцитарной взвеси или в обогащенных фракциях фагоцитирующих клеток. В качестве стандартных объектов фагоцитоза используют монодисперсные частицы латекса диаметром 1, 0-2, 0 мкм, суспензию убитых нагреванием бактерий или дрожжеподобных грибов.

Фагоциты смешивают с фагоцитируемым материалом в соотношении 1: 10 или 1: 100 и инкубируют при 37°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Затем пробирки центрифугируют и осадок ресуспензируют в капле сыворотки крови для приготовления мазка. В мазках, фиксированных краской Май-Чрюнвальда и окрашенных по Романовскому-Гимзе, подсчитывают процент фагоцитирующих клеток (ФП – фагоцитарный показатель) и кол-во поглощенных частиц на 1 клетку (ФЧ – фагоцитарное число).

У здорового человека ФП=40-80%, ФЧ=1-5.

29. Молекулярно-генетические методы обнаружения возбудителей инфекции в организме (ДНК и РНК зондирование, полимеразная цепная реакция).

В большей степени методы индикации НК нашли применение в диагностике вирусных инфекций, хотя существуют и спец системы для индикации некоторых прихотливых бактерий (легионелл, хламидий, энтерококков, микобактерий и др).

Наиболее распространены МЕТОДЫ ГИБРИДИЗАЦИИ ДНК И РНК. Принцип: ДНК (и РНК) способны специфически связываться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами искусственно созданных нитей ДНК (РНК), меченых изотопами или ферментами (пероксидаза, ЩФ…). Затем образцы исследуют методом ИФА.

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ. Была предложена в 1983г. Принцип: многократное образование копий (амплификация) определённого участка ДНК с помощью ДНК-полимеразы. ЭТАПЫ:

ТЕРМИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ 2-хнитевой ДНК на отдельные цепочки (93-95°С в течение 30 секунд).

ОХЛАЖДЕНИЕ СРЕДЫ И ВНЕСЕНИЕ ПРАЙМЕРОВ, комплементарных нуклеотидным последовательностям обоих цепочек. Используют синтетические праймеры – олигонуклеиды из 10-20 НКт, взаимодействующих с концами отдельных нитей исходной ДНК. Точнее добавляют 2 праймера (комплиментарны). Взаимодействие праймеров называют ОТЖИГОМ (реакция проходит за 20-60 с при 50-65°С).

Вносят СПЕЦ ТЕРМОСТАБИЛЬНУЮ ПОЛИМЕРАЗУ (оптимум 70°С), к/я синтезирует вторичные копии цепей ДНК (ампликоны).

Полученные 2-хнитчатые ДНК снова подогревают, остужают, вносят праймеры и т.д.

Т.к. полимераза устойчива к воздействию t°С, то нет необходимости постоянно её добавлять. После 30-80 циклов проводят идентификацию ДНК методом электрофореза. Подсчитано, что за 30-40 циклов из 1 матрицы образуется 100.000.000 (100 млн) ампликонов. Для подтверждения принадлежности ДНК возбудителю молекулы можно подвергнуть рестрикции специфическими эндонуклеазами или провести ДНК-гибридизацию. ПЦР – оч чувствительный метод, теоретически достаточно иметь в среде лишь 1 молекулу ДНК.

Для ДИАГНОСТИКИ ИНФ ЗАБ-Й маркёром возбудителя явл его геном. Для амплификации отбирают какой-нибудь УНИКАЛЬНЫЙ ген, наиболее отличающий его от других патогенов.

30. Биопрепараты для создания активного иммунитета. Вакцины, анатоксины. Принципы их получения.

Препараты для иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных заболеваний делятся на:

вакцины и анатоксины – для индукции специфического иммунного ответа с формированием активного противоинфекционного иммунитета за счет мобилизации механизмов иммунологической памяти;

иммунные сыворотки и Ig – содержат готовые специфические АТ (Ig), введение которых в Ò приводит к немедленному приобретению пассивного гуморального иммунитета, способного защитить организм от интоксикации или инфекции.

ВАКЦИНЫ (Э. Дженнер, Л. Пастер) – биопрепараты, предназначенные для создания активного искусственного иммунитета. Делятся на живые, убитые, химические, анатоксины и ассоциированные. Готовят т/же аутовакцины – из штаммов мкÒ, выделенных непосредственно из Ò чка.

ЖИВЫЕ ВАКЦИНЫ создают напряженный иммунитет, сходный с постинфекционным. Готовятся из АТТЕНУИРОВАННЫХ штаммов (т.е. вирулентные свойства утрачены, но при введении в Ò способны прижиться и вызвать выработку ВСЕХ ВИДОВ иммунитета). В большинстве случаев достаточно однократной вакцинации живой вакциной, т.к. вакцинный штамм может размножаться и персистировать в Ò. Применение живых вакцин опасно для людей (особенно детей) с врожденными или приобретенными иммунодефицитными состояниями → тяжелые инфекционные осложнения. Для получения используют следующие методы:

селекционный метод, направленный на выращивание мкÒ в неблагоприятных условиях отбор микробов со ↓ вирулентностью – классический метод получения живых вакцин (Пастер – сиб язва).

Адаптация мкÒ к Ò невосприимчивого Ж! или пассирование через ткани и органы, к/е не являются входными воротами для данного мкÒ.

Отбор мутантных штаммов со ↓ вирулентностью, выделенных из природы.

Методы генной инженерии.

УБИТЫЕ ВАКЦИНЫ готовят из мкÒ, обладающих максимально выраженной иммуногенностью. Их выращивают (на биопредприятиях), затем инактивируют t°С (55-60° в течение 1часа), УФ или хим в-вами (формалин, фенол, спирт и др) в условиях, исключающих денатурацию антигенов. Для профилактики – брюшного тифа, паратифов А и В, коклюша, бруцеллёза, лептоспироза… Для лечения – при вялотекущих и хронических инфекциях: бруцеллёз, туляремия, дизентерия, гоноррея, коклюш… Убитые вакциины создают ненапряжённый иммунитет.

Аттенуированный или убитый возбудитель – это множество различных АГ детерминант, но индуцировать защитный иммунитет могут немногие из них Þ очистить вакцинный препарат от токсичных или аллергизирующих компонентов. Выделение из Б! # АГ компонентов позволило получить вакцины второго поколения – ХИМИЧЕСКИЕ. По сравнению с др вакцинами они менее реактогенны. Аналогами Б! хим вакцин являются вирусные субъединичные (расщепленные) вакцины, содержащие лишь некоторые наиболее иммуногенные компоненты вирионов (противогриппозная вакцина, включающая гемагглютинин и нейраминидазу). Субъединичные вакцины оказались наименее реактогенными, но и наименее иммуногенными.

Для ↑ ИММУНОГЕННОСТИ химических и субъединичных вакцин к ним добавляют разного рода адъюванты (adjuvans – помогающий, поддерживающий): гидрооксид алюминия, алюминиево-калиевые квасцы, фосфат алюминия и др. Те же адъюванты добавляют для повышения иммуногенности и к препаратам анатоксинов.

АНАТОКСИНЫ получают путем обработки токсинов формалином (0, 3% раствор) при температуре 37°С в течение 30 дней. При этом токсин утрачивает ядовитость, но сохраняет способность индуцировать синтез АТ. Анатоксинами широко пользуются для выработки активного антитоксического иммунитета при специфической профилактике столбняка, дифтерии и других инфекций, возбудители которых продуцируют экзотоксины.

ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ:

получение в чистом виде эпитопов и их связывание с молекулой-носителем (природные белки, синтетические полиэлектролиты).

Генноинженерные методы: определяют гены, контролирующие нужные АГ детерминанты, переносят в геном других мкÒ и клонируют в них, добиваясь экспрессии этих генов в новых условиях.

На основе антиидиотипических антител.

Использование липосом для введения АГ. Благодаря их сходству с клеточными мембранами они не токсичны для Ò, заключенное в них вещество защищено от растворения в крови и они могут адсорбироваться на клетках. Такие «липосомные» вакцины вызывали тысячекратное усиление иммунного ответа.

Часть вакцин используется для обязательной ПЛАНОВОЙ ВАКЦИНАЦИИ детей: противотуберкулезная вакцина BCG, полиомиелитная вакцина, коревая, паротитная, АКДС.

Другие вакцины обязательны для введения определенным контингентам в определенных районах (например, вакцина против клещевого энцефалита) или при опасности профессиональных контактов с возбудителем.

Общие требования к вакцинам: высокая иммуногенность, ареактогенность (отсутствие выраженных побочных реакций), безвредность и минимальное сенсибилизирующее действие.

31. Биопрепараты для создания пассивного иммунитета. Лечебные сыворотки и иммуноглобулины. Принципы их получения.

Препараты для иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных заболеваний делятся на:

вакцины и анатоксины – для индукции специфического иммунного ответа с формированием активного противоинфекционного иммунитета за счет мобилизации механизмов иммунологической памяти;

иммунные сыворотки и Ig – содержат готовые специфические АТ (Ig), введение которых в Ò приводит к немедленному приобретению пассивного гуморального иммунитета, способного защитить организм от интоксикации или инфекции.

ИММУННЫЕ СЫВОРОТКИ И Ig

При многих инфекциях АТ играют защитную роль. Однако накопление достаточного количества антител наблюдается, как правило, не ранее чем через 2-3 нед после начала заболевания. Поэтому искусственное создание пассивного иммунитета показано при многих инфекциях как с целью серотерапии, так и с целью экстренной серопрофилактики (при непосредственной угрозе заболевания).

Иммунные сыворотки получают путем гипериммунизации лошадей, от которых можно получить сравнительно много крови, с последующей обработкой иммунной сыворотки (для концентрации АТ и очистки от балластных веществ методами ферментирования и диализа («Диаферм»)).

Силу антитоксических сывороток измеряют в международных единицах (ME) по способности нейтрализовать определенную дозу токсина.

Т.к. лошадиные сыворотки являются гетерологичными, они могут вызывать, особенно при повторном введении в организм, аллергические реакции на лошадиный белок Þ обязательный предварительный контроль на чувствительность организма к лошадиному белку (внутрикожная проба с 0, 1 мл лошадиной сывороткой в разведении 1: 100). Введение допустимо только если нет выраженной кожной реакции в течение 20–30 мин.

Антитоксические иммунные сыворотки нужно вводить как можно раньше от момента заражения, так как АТ нейтрализуют токсин только до его адсорбции на клетке-«мишени».

Для уменьшения побочных эффектов из иммунных сывороток выделяют чистые Ig, также используют гомологичные человеческие сыворотки. Сырьем для приготовления нормального Ig человека может служить плазма крови доноров, сыворотка плацентарной крови. Использование Ig человека для экстренной профилактики и лечения кори, коклюша, менингококковой инфекции, полиомиелита, скарлатины обусловлено присутствием АТ против соответствующих возбудителей в крови взрослых людей, вследствие бытовой иммунизации, перенесенных инфекций или вакцинации против них.

От специально иммунизированных доноров получают сыворотку крови для приготовления Ig целенаправленного действия для экстренной профилактики и лечения столбняка, клещевого энцефалита, гриппа, стафилококковой инфекции. Противоэнцефалитный иммуноглобулин получают из сывороток крови людей, проживающих в местах распространения данного заболевания, содержащих достаточно высокий уровень специфических противовирусных АТ.

Для создания пассивного иммунитета очень перспективно получение препаратов моноклональных АТ на основе гибридом из клеток человека. Такие препараты будут обладать наиболее целенаправленным действием при минимальных возможностях осложнений.

32. Диагностические биопрепараты. Диагностикумы для серологических реакций. Диагностические сыворотки. Принципы их получения.

Диагностикумы бывают:

а) антигенными – получают из возбудителя, либо ипользуют самого возбудителя

б) антительными – иммунные диагностические сыворотки – получают иммунизацией лабор. животных.

Напр., используют сыворотки против лейкоцитарных АГ – для типирования донора и реципиента (при пересадках органов).

33. Иммунологическая толерантность. Определение понятия, механизмы формирования иммунологической толерантности.

Иммунологическая толерантность – явление специфической иммунной ареактивности, приобретенной в результате предшествующего контакта с этим Аг. Это явление неспособности иммунной системы ответить на присутствие Аг.