Определение α2-антиплазмина

α ₂ -антиплазмин - самый быстрый «реактив­ный» ингибитор плазмина, он не позволяет при­сутствовать плазмину в крови в свободном виде. α ₂ -антиплазмин, помимо плазмина, ингибирует активаторы плазминогена - урокиназу (u-РА) и тка­невой активатор (t-PA). Дефицит α ₂-антиплазмина встречается относительно редко, но если возникает, то это сопровождается тяжелым геморрагическим синдромом, проявляющимся диапедезными крово­течениями. Основной причиной кровотечений яв­ляется присутствие свободного плазмина, который разрушает все тромбы и деградирует фибриноген.

Определение α ₂-антиплазмина вместе с опре­делением ингибитора тканевого активатора плаз­миногена типа 1 (PAI-1), XIII фактора можно рас­сматривать как тесты 2-го уровня, которые необ­ходимо выполнять, если скрининговые тесты (ПВ, АЧТВ, ТВ и определение функции тромбоцитов) нормальны, а больной страдает кровотечениями.

Уменьшение содержания (активности) α ₂ -ан-типлазмина наблюдается при:

• врожденном (наследственном) дефиците;

• заболеваниях печени (нарушается синтез α ₂-ан-
типлазмина);

Рис. 122. Принцип определения плазминогена хромогенным методом. СК - стрептокиназа

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

• ДВС-синдроме;

• лейкозах;

• нефротическом синдроме;

• интенсивной тромболитической терапии, ко­
торая может вызвать потребление α ₂-анти-
плазмина.

После экстракорпорального кровообраще­ния с использованием АИК может наблюдаться истощение α ₂-антиплазмина, что приводит к ги-перфибринолизу, сочетающемуся с истощением фибриногена, деградацией плазмином плазмен­ных белков (в том числе факторов гемостаза), разрушением тромбоцитов и кровотечениями.

Принцип определения α ₂-антиплазмина подо­бен технологиям определения других ингибито­ров (рис. 123). Так как происходит быстрая инак­тивация плазмина α ₂-антиплазмином, то стадия ингибирования и стадия измерения стартуют практически одновременно (что позволяет повы­сить специфичность метода при сниженной актив­ности ингибитора в плазме).

Опрелеление ингибитора активатора плазминогена типа 1 (PAI-1)

PAI-1 в качестве основного ингибитора уро-киназы (u-РА) и тканевого активатора (t-PA) иг­рает важную роль в контроле за активностью фибринолиза. Определение PAI-1 часто включа-

ется как один из тестов профиля (панели) оценки тромбофилии. У больных с кровотечениями не­ясного генеза с нормальными скрининговыми тестами дефицит PAI-1 может быть причиной па­тологии. Истинный дефицит выявляется относи­тельно редко, но сопровождается тяжелыми кро­вотечениями.

Повышение PAI-1 встречается достаточно ча­сто, так как PAI-1 - белок острой фазы. Это име­ет клиническое значение, так как является при­чиной рецидивирующего венозного тромбоза и отмечается часто у мужчин в преклонном возрас­те. PAI-1 повышается при:

инфекционных и воспалительных процессах;

послеоперационном периоде;

злокачественных опухолях;

ожирении;

гипертриглицеридемии;

лечении дексаметазоном.

У больных с инфарктом миокарда персисти-рующий подъем PAI-1 рассматривается как не­благоприятный прогностический признак.

Определение PAI-1 состоит из нескольких этапов. На первом этапе необходимо инактиви-ровать ингибиторы плазмина - α ₂-антиплазмин и α ₂-макроглобулин. Затем используется общий принцип определения остаточной активности до­бавленного в избытке фактора, который должен подавляться исследуемым ингибитором (рис. 124).

Рис. 123. Принцип определения α ₂-антиплазмина хромогенным методом. ПАП - комплекс плазмин-антиплазмин

Рис. 124. Принцип определения ингибитора тканевого активатора плазминогена типа 1 (РАМ) хромогенным методом. u-PA - урокиназа, t-PA - тканевой активатор

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

При использовании u-РА метод в техничес­ком исполнении несколько проще, чем при ис­пользовании избытка t-PA, и может быть авто­матизирован на современных анализаторах.

Содержание PAI-1 в системе циркуляции под­вержено суточным ритмам, поэтому пробы при системном анализе необходимо брать в одно вре­мя, лучше по утрам. Кроме того, PAI-1 - один из самых неустойчивых белков плазмы, поэтому определение необходимо проводить сразу после взятия крови, транспортировка может привести к потере активности PAI-1 в пробе.

Завышенные результаты теста можно полу­чить при увеличении активности PAI-2. Этот ин­гибитор повышается при беременности, поэтому в данном случае исследование PAI-1 описанным выше методом может дать ложные результаты. В последнее время активно используется опреде­ление PAI-1 методом ELISA или комбинацией им-мунохимических и функциональных методов.

Определение тканевого активатора плазминогена (t-PA)

Тканевой активатор плазминогена (t-PA) ос­вобождается в кровоток из эндотелиальных кле­ток сосудистой стенки, где он синтезируется. По­этому диагностика дефицита t-PA основывается не только на определении концентрации t-PA в крови, но и на способности освобождаться из со­судистой стенки при стрессовых воздействиях, в

частности при манжеточной пробе (дозирован­ном пережатии вен). Сначала определяют базо­вый уровень t-PA, потом на 10-15 минут на пред­плечье накладывают жгут или раздувают манжет­ку, вызывающую венозный стаз, затем берут вто­рую порцию крови, в которой повторно опреде­ляют t-PA. Сравнивают результаты обеих проб. Из-за быстрой инактивации тканевого актива­тора плазминогена PAI-1 и другими ингибитора­ми пробы крови необходимо немедленно закислить, чтобы предупредить инактивацию t-PA in vitro. В настоящее время выпускаются специальные пробирки с кислым антикоагулянтом. t-PA име­ет суточный ритм, поэтому его необходимо оп­ределять так же, как PAI-1.

t-PA обладает высокой амидазной активнос­тью, позволяющей эффективно использовать для его определения метод хромогенных субстратов. Однако при низких концентрациях t-PA в плазме требуется проведение дополнительных процедур непрямого определения активности фермента че­рез плазминоген и использование растворимого фибрина (рис. 125).

Определение t-PA проводится у больных с тромбофилией как часть панели тестов на выявле­ние причины тромбофилии, особенно при нагру­зочных манжеточных пробах. Повышение t-PA после инфаркта миокарда рассматривается как неблагоприятный фактор. Нарушение освобожде­ния t-PA после венозного стаза описано у боль­ных с тромбозами и патологией почек.

Рис. 125. Принцип определения тканевого активатора плазминогена (t-PA) хромогенным методом

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Тесты активации свертывания крови

Определение D-димеров

D-димеры - это специфические продукты дег­радации фибрина, входившего в состав тромба. Они образуются в процессе лизиса сгустка крови под влиянием плазмина и некоторых неспецифи­ческих фибринолитиков (рис. 60). Концентрация D-димеров в сыворотке пропорциональна актив­ности фибринолиза и количеству лизируемого фибрина. Этот тест позволяет судить об интен­сивности процессов образования и разрушения фибриновых сгустков.

Определение D-димеров проводится иммуно-ферментным методом с использованием монокло-нальных антител, иммунодиффузии, методом тур-бидиметрии, латекс-агглютинации (табл. 32). Во всех методах исследования используются моно-клональные антитела к эпитопам на D-димере, которые образуются при расщеплении нераство­римого фибрина плазмином. Этих эпитопов нет на фибриногене и растворимых фибрин-мономе­рах, поэтому D-димеры - показатель того, что в процессе фибринолиза расщепляется именно фиб­рин, а не фибриноген или фибрин-мономеры. По­скольку эти антитела не взаимодействуют с фиб­риногеном, исследования могут проводиться как в плазме, так и в сыворотке.

Принцип теста, основанный на методе ELISA на твердой фазе (стриппированные планшеты), с нанесенными на поверхность пластика первичны­ми антителами, показан на рис. 126. Так как D-ди­меры - не стандартизованный аналит, то разные методы могут показывать разные результаты,

несмотря на то, что используются специфические антитела и калибраторы.

На определение D-димеров практически не оказывает влияние техника взятия крови, примесь тромбоцитов, не требуется использования инги­биторов для подавления других факторов.

Повышение уровня D-димеров в крови оп­ределяется при возникновении венозных тром­бозов, атеротромбозе, тромбоэмболии легочной артерии, ДВС-синдроме, после операций, осо­бенно при большом операционном поле и дру­гих состояниях с повышенным образованием

Рис. 126. Принцип метода ELISA для определения D-ди­меров. Специфические антитела нанесены на твердую фазу (пластик). С ними взаимодействует субъединица D из пробы и остается иммобилизованной на твердой фазе, До­бавляются проявляющие антитела, конъюгированные с фер­ментом, которые могут взаимодействовать только с D-ди-мерами. Несвязавшиеся антитела отмываются, добавляет­ся субстрат для фермента, по изменению окраски раство­ра определяется количество D-димеров, D-мономеры, фор­мирующиеся при деградации фибриногена и входящие в состав ПДФ, не определяются тестом на D-димеры

Характеристики методов определения D-димеров

Таблица 32

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

фибрина. D-димеры достаточно долго циркули­руют в крови, время их полувыведения состав­ляет более 24 ч, повышение D-димеров может персистировать в течение нескольких недель после острого тромбоза.

Уровень D-димеров повышен у больных с тромбозом глубоких вен бедра, с тромбоэмболи­ей легочной артерии, он может повышаться пос­ле обширных хирургических вмешательств, травм, при онкологических заболеваниях. На зна­чение D-димеров влияют такие факторы, как ве­личина тромба, время от начала клинических проявлений до назначения антикоагулянтной те­рапии, прием антикоагулянтов, на фоне которых уровень D-димеров постоянно снижается. Поэто­му более важной для исключения диагноза тром­боза является отрицательная диагностическая значимость теста. Причем для разных тестов от­рицательная диагностическая значимость колеб­лется от 78 до 100%, она выше у более чувстви­тельных методов, что характерно для ИФА-ди-агностики. D-димеры определяются в моче, но их появление интерпретируется как маркер почечной дисфункции.

Продукты деградации фибрина/фибриногена (ПДФ)

Продукты деградации фибрина/фибриногена определяются традиционно в общей группе с ис­пользованием поликлональных антител. При этом антитела могут взаимодействовать с эпито-пами фибриногена, поэтому требуется не только использование сыворотки, но и полное удаление фибриногена с добавлением к крови тромбина или змеиного яда с тромбиноподобным эффек­том. В последнее время для метода ELISA стали использовать моноклональные антитела к нео-эпитопам, которые образуются при деградации фибрина или фибриногена под влиянием плазми-на. Тем не менее трудно отдифференцировать ПДФ, образующиеся при деградации фибрина из тромба, от ПДФ, сформировавшихся при дегра­дации фибриногена, особенно при использовании активаторов фибринолиза. Для определения ПДФ широко распространен метод латекс-агглю­тинации. Этот метод легко автоматизируется на турбидиметрах, но характеризуется относитель­но низкой специфичностью.

Положительная проба - содержание ПДФ в плазме/сыворотке свыше 0, 5 мкг/мл - указывает на:

• ДВС-синдром;

• тромбоз глубоких вен;

• тромбоэмболию легочной артерии;

• метастазы в легкие, рак яичников;

• фибринолитическую терапию.

Тромбин-антитромбиновый комплекс (ТАТ)

Определение ТАТ - новый тест в диагностике ДВС-синдрома, он активно внедряется в практи­ку клинико-диагностических лабораторий. Кли­ренс ТАТ из системы циркуляции достаточно бы­стрый, он удаляется в течение нескольких минут. Поэтому присутствие ТАТ в плазме свидетельству­ет об образовании тромбина in vivo непосредствен­но в момент взятия крови на исследование и о воз­можности истощения антикоагулянтов.

В методе ELISA на твердую фазу нанесены антитела к тромбину. После отмывки проявляю­щие антитела связываются с антитромбином, при­сутствующем в ТАТ, оценка количества ТАТ про­водится цветной реакцией. Определение ТАТ очень информативно в острой ситуации, непос­редственно при тромбообразовании. В этом пла­не определение ТАТ по диагностическому значе­нию схоже с определением фибринопептида А (ФПА), однако для ТАТ менее критичными яв­ляются требования к процедуре взятия крови. Иногда тест с некоторыми модификациями ис­пользуется для определения антитромбина (AT).

Фрагменты протромбина F1 +2

F1+2 - также новый тест, он отражает актив­ность превращения протромбина в тромбин с уча­стием протромбиназного комплекса (фактор Ха, фактор Va, фосфолипиды и Са²⁺), который фор­мируется при активации системы плазменно­го гемостаза (рис. 127).

Определение F1+2, так же как ТАТ, проводится с целью диагностики состояния гиперкоагуляции, которое может быть значимым при остром и хрони­ческом ДВС, тромбозе глубоких вен бедра, эмболии легочной артерии, злокачественных опухолях и ост­рых миелоидных лейкозах (протекающих с актива­цией системы свертывания), наличии факторов рис­ка тромбоэмболии, остром инфаркте миокарда и

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

синдрома. F1+2, в отличие от ТАТ, имеют относи­тельно продолжительный период циркуляции в сис­теме кровотока. Состояние гиперкоагуляции мож­но зарегистрировать с помощью как ТАТ, так и F1+2, тогда как состояние гипокоагуляции можно выявить только по уменьшению F1+2. Поэтому оп­ределение F1+2 проводится иногда с целью монито­ринга антикоагулянтов непрямого действия, эффек­тивности профилактического подкожного или внут­ривенного введения гепарина.

Определение F1+2 можно использовать для решения вопроса о назначении/неназначении те­рапевтических вмешательств у пациентов с дефи­цитом антикоагулянтов и при беременности в слу­чае риска возникновения тромбозов (табл. 33).

Фибринопептид А (ФПА, FPA)

ФПА отщепляется от молекулы фибриногена тромбином (рис. 44), поэтому при тромбинемии количество ФПА в плазме увеличивается. Опреде­ление ФПА достаточно давно используется как маркер активации гемостаза. В современных набо­рах используется метод ELISA с моноклональны-ми антителами. ФПА - очень чувствительный тест на потребление фибриногена, его концентрация повышается при различных заболеваниях с тром-

Таблица 33

Примеры решения вопроса о назначении антикоагулянтной терапии у 3 пациентов с дефицитом антитромбина (референтные значения AT > 80%, F1 +2 < 1, 4 нмолъ/л)

Полужирным шрифтом выделены показатели, выходящие за границы принятого в лаборатории референтно­го диапазона.

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

боэмболией. Результаты теста очень сильно зави­сят от процедуры взятия крови, даже небольшие отступления от прописанной схемы могут вызвать значительные сдвиги в уровне ФПА в пробе.

Растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК)

При ряде форм патологии, характеризующихся активацией свертывания крови (ДВС, тромбозы, тромбофилии), происходит расширение пула фибри­ногена. В норме в крови из пула фибриногена присут­ствует практически только сам фибриноген в коли­честве 1, 8-3, 5 г/л. Все остальные продукты (рис. 128) находятся в минимальном количестве, которое прак­тически не определяется лабораторными тестами.

При ДВС-синдроме за счет свободного тром­бина происходит постоянный процесс трансформа­ции фибриногена в фибрин с появлением в крови фибринопептидов А и В, накоплением мономеров фибрина. Активация фибринолиза сопровождает­ся повышенным образованием ПДФ. ПДФ взаимо­действуют с фибрин-мономерами, увеличивая ко­личество растворимых фибрин-мономерных комп­лексов (РФМК). РФМК - это фибрин-мономеры и олигомеры, а также их комплексы с ПДФ (рис. 129).