Правила работы с паровыми стерилизаторами следующие.

1. Перед началом стерилизации проверить исправность манометров, упругость резиновой прокладки, герметичность крепления крышки стерилизационной камеры.

2. Наполнить котелок водой через воронку до уровня отметки на кожухе водомерной трубки и закрыть верхний кран водоуказательной колонки.

3. Загрузить материалы в стерилизационную камеру и плотно закрыть крышку стерилизатора.

4. Закрыть спускной кран и выключить нагревательную систему.

5. После достижения давления пара в котле 2, 0±0, 2 кгс/см открыть спускной кран, а затем вентиль патрубка, соединяющего котелок со стерилизационной камерой. Появление из крана непрерывной струи пара считать началом продувки (вытеснение воздуха из стерилизационной камеры), которая должна продолжаться не менее 30 мин.

6. Закрыть спускной кран и довести давление в стерилизационной камере до нужного уровня, учитывая соотношение показания манометра и температуры кипения воды (табл. 1)

7. Окончив стерилизацию, выключить электрический подогрев и закрыть кран на патрубке.

8. Открыть спускной кран и постепенно выпустить пар из стерилизационной камеры в сосуд с водой.

9. После снижения давления в стерилизационной камере до 0 открыть крышку стерилизатора и приступить к ее разгрузке; при открытии крышки ранее указанного срока стерилизуемая жидкость вскипает и может вытолкнуть пробки из сосудов вследствие быстрого падения давления.

Питательные среды, перевязочные материалы и белье стерилизуют при 1 кгс/см в течение 15-20 мин, питательные среды с углеводами - при 0, 5 кгс/см в течение 15 мин, а патогенный материал обеззараживают при 1, 5-2 кгс/см.

Контроль режима стерилизации осуществляется с помощью химических термотестов и искусственных биотестов.

Химические термотесты представляют собой вещества, изменяющие свои цвет или физическое состояние при стерилизации, в частности, имеющие различную температуру плавления (табл. 2).

Запаянные ампулы с порошком, смешанным с краской, помещают в стерилизационную камеру. При достижении в камере определенной температуры порошок плавится, образуя сплав, окрашенный в цвет добавленной краски.

1. Бактериологический контроль работы стерилизаторов проводят после монтажа и ремонта аппаратуры, а также в процессе его эксплуатации (плановый - 1 раз в месяц и при получении неудовлетворительных результатов контроля).

Контроль эффективности работы стерилизаторов осуществляется бактериологическим методом, используя биотесты на основании гибели спор тест-культуры.

Биотесты представляют собой флаконы из стеклянной трубки для лекарственных средств ФИ/1-5НС 1 ТУ 64-0709-10-88 (инсулиновые флаконы) или чашечки из алюминиевой фольги (диск размером 14 мм с луночкой -вдавление от неоточенного края карандаша), содержащие высушенные споры тест-культуры Вас. Stearothermophilus BKM В-718, помешенные в пакеты из упаковочной бумаги (ОСТ 42-21- 2-85). Упакованные тесты нумеруют и раз­мещают в контрольные точки паровых стерилизаторов (5-10 тестов). По окончании стерилизации биотесты подвергают бактериологическому исследованию.

2. Штамм Вас. Stearothermophilus BKM B-7I8 - подвижная термофильная палочка, по Граму окрашивается положительно, культивируется при t 55 ± 1°С, исключающей развитие других широко распространенных микроорганизмов.

Споры овальные, расположенные центрально. На мясопептонном бульоне (рН 7, 3±0, 1) через 24 часа образует помутнение среды, на мясо-пептониом агаре (рН 7, 3±0, 1) - слабо выпуклые колонии диаметром 2-4 мм с ровным краем. Штамм непатогенен для человека и животных.

3. Приготовление биотеста.

В ампулу с лиофилизированнной культурой вносят 0, 2 мл стерильной водопроводной воды и оставляют в течение 30 минут при комнатной температуре. 1-2 капли культуры засевают в 2 пробирки с бульоном (МПБ. Хоттингера, питательный сухой) с 0, 5 % глюкозы. Суточную бульонную культуру засевают в пробирки на скошенный агар (Хоттингера, мясопептонный, сухой питательный), Для получения спор культуру, выращенную на твердой питательной среде, смывают 5 мл стерильной водопроводной воды и переносят во флаконы со скошенным картофельно-пептонным агаром. Взвесь покачиванием флакона равномерно распределяют по поверхности среды, инкубируют при 55 С в течение 10-12 суток в наклонном положении агаром вверх. Для создания достаточной влажности в термостат помещают открытые емкости с водой. На 7, 10 и 12 сутки проверяют интенсивность спорообразования. Достаточным количеством считают 80-90 спор в поле зрения. Культуру смывают стерильной дистиллированной водой. С целью освобождения от вегетативных клеток суспензию прогревают в водяной бане при температуре 65-70˚ С в течение 30 минут, центрифугируют трехкратно с частотой вращения 2000 об/мин, по 15 минут, промывая осадок стерильной дистиллированной водой после каждого центрифугирования, отмытые споры суспензируют в стерильной дистиллированной воде в соотношении 1: 1 по объему. Суспензию спор хранят в холодильнике при температуре 4°С в стерильных пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками с резиновыми колпачками (срок хранения 2года). Чистоту культуры на всех этапах культивирования контролируют высевом на агаровые пластинки. Для определения титра жизнеспособных спор 0, 1 мл исходной суспензии десятикратно разводят до 10⁷ стерильной дистиллированной водой, высевая на три агаровые пластинки по 0, 1 мл ориентировочно из 10⁵-10⁷ (предел разведения зависит от титра полученных спор). Посевы инкубируют в течение 48 часов, проводят подсчет выросших колоний. Титр жизнеспособных спор в исходной суспензии определяют как среднее арифметическое число колоний с учетом разведения исходной суспензии и объема пробы для посева.

Пример расчетов. Предположим, что при посеве на 3 чашки Петри с агаром суспензии в разведении 1: 100000 (10⁵), подсчитано 140, 110 и 134 колонии. Аналогичные высевы из разведений 10⁶ привели к образованию 12, 14 и 16 колоний; из 10⁷ - 5, 3 и 7 колоний. Вычисляем общее число колоний, а затем среднее количество колоний для каждого разведения 128, 14 и 5.

Из расчета посевной дозы (0, 1 мл на каждую чашку) вычисляем титры жизнеспособных спор в 1 мл исходной суспензии с учетом разведения, далее находим среднее арифметическое число колоний:

128х10х10⁵ = 12, 8х10⁷;

14х10х10⁶ = 14.0х10⁷;

5х10х 10⁷ = 50, 0х10 ⁷.

Таким образом, титр исходной суспензии составит (12, 8+14, 0 +50, 0)х10⁷: 3 = 2, 5х10⁸спор в 1 мл. Исходная суспензия должна содержать не менее 2, 5х10⁷-2, 5х10⁸ спор в 1 мл.

Споры в количестве 5х10⁵-5х10⁶ вносят из исходной суспензии с помощью дозатора пипеточного (ТУ 64-1-3329 - 81) по 0, 02 мл в носители (стерильные инсулиновые флакончики с ватно-марлевой пробкой или чашечки из алюминиевой фольги, разложенные в чашки Петри), подсушивают в термостате при температуре 37°С или в эксикаторе над осушителем (силикогель, хлористый кальций) при комнатной температуре в течение 24 часов.

Для определения фактической обсемененности исследуют не менее 3 биотестов от каждой группы. Во флаконы (чашечки) вносят по 1, 0 мл стерильной дистиллированной воды (чашечки из алюминиевой фольги отмывают в широкогорлых пробирках с бусами в 10, 0 мл) и встряхивают в течение 10 минут на аппарате для встряхивания жидкостей с последующим высевом на 3 агаровые пластинки по 0, 1мл суспензии из 3 последовательных 10-кратных разведений.

4.Определение устойчивости спор тест-культур к действию водяного насыщенного пара под избыточным давлением проводят при температуре 120±2°С.

Биотесты в упаковочной бумаге помещают в стерилизационной коробке в камеру парового стерилизатора. После набора давления в водопроводной камере 0, 11 ± 0, 01 МПа (1, 1 -+0, 1 кгс/см²) проводят продувку парового стерилизатора (вытеснение воздуха паром из камеры парового стерилизатора) в течение 10 минут при открытом спускном кране и давлении в стерилизационной камере от 0, 01 до 0, 02 МПа (от 0, 1 до 0, 2 кгс/см²). После продувки доводят давление пара в стерилизационной камере до 0, 11 ± 0, 01 МПа (1, 1 ± 0, 1 кгс/см²) температура 120 ± 2˚ С и через 5 минут (времени выживания спор тест-культуры) с момента установления давления спускают пар. Для уменьшения времени воздействия пара до и после экспозиции подъем давления проводят максимум в течение 8 минут, спуск - в течение 3 минут.

Аналогичное исследование проводят в течение 15 минут выдержки (время гибели спор тест-культуры). Контроль температуры осуществляют максимальными термометрами. По окончании времени выдержки биотесты вынимают из стерилизатора и проводят бактериологическое исследование.

Партию биотестов считают годными для использования, если показатели устойчивости спор тест-культуры соответствуют вышеописанным требованиям.

5. Для определения эффективности работы стерилизатора в обеззараженные биотесты и контрольный тест (без стерилизации) стерильно вносят по 5 мл питательной среды, инкубируют при 55°С в течение 7 суток при ежедневном просмотре посевов, делая высевы на агаровые пластинки из проросших емкостей.

При использовании полусинтетической среды с индикатором феноловым красным рост тест-культуры определяют по изменению красного цвета среды (рН 7, 7-+ 0, 1) на желто-оранжевый (рН 6, 7 ± 0, 1) за счет разложения глюкозы с образованием кислоты. В целях исключения ложноотрицательного результата (при наличии роста тест-культуры отсутствует изменение цвета питательной среды) флаконы (пробирки) должны быть плотно закрыты стерильными резиновыми пробками (№ 7, 5; 12, 5).

Отсутствие роста тест-культуры указывает на эффективность работы стерилизатора. Рост других культур микроорганизмов относят за счет вторичного обсеменения. При наличии роста тест-штаммов проводится повторный контроль на удвоенном количестве биотестов. Если и при повторной проверке тест-культуры не инактивируются осуществляют тщательный контроль технического состояния аппарата и контрольно-измерительных приборов. При отсутствии роста тест-культуры в контрольном биотесте (не подвергшемся стерилизации) устанавливается причина (нежизнеспособность тест-культуры, несоблюдение методики приготовления биотестов, питательных сред, условий культивирования).

6. Для спорообразования используют:

- картофельно-пептонный агар (пептон-5, 0; мел-1, 0; агар- 25, 0; картофельная вода - 1000, 0 мл), рН - 7, 1±0, 1. Сырой картофель (200, 0 г очищенного картофеля на I л водопроводной воды) тщательно моют, очищают от кожуры и глазков, нарезают мелкими ломтиками, заливают водопроводной водой и кипятят 30 минут после закипания (молодой картофель употреблять нельзя). Отвар отстаивают и фильтруют в холодном состоянии через ватно-марлевый фильтр. Доводят объем фильтрата до первоначального. Устанавливают рН 7, 1 ± 0.1. Добавляют пептон и агар. Нагревают, помешивая до полного растворения агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, после чего добавляют мел. Разливают по флаконам, стерилизуют при 120°С в течение 30 минут. После стерилизации среду во флаконах скашивают;

- пшеннчный агар (пшеничная крупа " Артек" пли " Полтавская" - 500.0:

агар - 25, 0; дистиллированная вода - 1000, 0 мл), рН 7, 3±0, 1. Пшеничную крупу " Артек" (" Полтавская") заливают дистиллированной водой. Через 12 часов настой аккуратно сливают, не выжимая, доводят до первоначального объема, добавляют агар. и растапливают на водяной бане или в автоклаве (текучим паром 1 час). Остывший агар выкладывают на противень и срезают осадок. Агар растапливают на водяной бане, постоянно помешивая. Устанавливают рН 7, 3±0, 1. Разливают во флаконы. Стерилизуют текучим паром по 1 часу в течение 3 суток. После стерилизации среду скашивают.

7. Для контроля используют бульон Хоттингера - рН 7, 3±0, 1; агар Хоттингера рН 7, 3±0, 1; питательный бульон сухой - рН 7, 1±0, 1; среду питательную для контроля стерильности сухую - рН 7, 0+0, 1; бульон из перевара кровяных сгустков; полусинтетическую среду с индикатором феноловым красным - рН 7, 7±0.1 (аммоний фосфорнокислым однозамещенный – NH₄ H₂PO₄- 1, 0 г; магний сернокислый – MgSO₄- 0, 2г; калий хлористый - КСl - 0, 2г; глюкоза - 5, 0г; феноловый красный - 0.02г; бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 140-160 мг% - 200, 0 мл; дистиллированная вода - 800, 0 мл - рН 7, 7±0, 1. Компоненты смешивают и растворяют при нагревании на водяной бане, доводят рН до 7, 0±0, 1, разливают во флаконы, стерилизуют при 110˚ С в течение 30 минут).

Стерилизация текучим паром (дробная стерилизация) - это обеспложивание объектов, разрушающихся при температуре выше 100°С (питательные среды с аммиачными солями, молоко, желатин, картофель, некоторые углеводы). Обеспложивание проводят в паровом стерилизаторе при открытом спускном кране и незавинченной крышке или в аппарате Коха по 15-30 мин в течение 3 дней подряд. При первой стерилизации погибают вегетативные формы микробов, не­которые споры при этом сохраняются и прорастают в вегетативные особи в процессе хранения питательных сред при комнатной температуре. Последующая стерилизация обеспечивает достаточно надежное обеспложивание объекта.

Тиндализация - это стерилизация материалов, легко разрушающихся при высокой температуре (сыворотки, витамины); стерильность достигается повторным прогреванием объекта при температуре 60°С по часу ежедневно в течение 5-6 дней подряд.

Пастеризация - это обеспложивание многих пищевых продуктов (вино, пиво, соки), при этом достигается только частичная стерильность; споры микроорганизмов не уничтожаются. Обеспложивание проводят при 65-80°С в течение 10-60 мин.

Стерилизацию ультрафиолетовыми лучами применяют для обеспложивания воздуха в микробиологических лабораториях, боксах, операционных. Ее проводят бактерицидными лампами различной мощности (БУВ-15, БУВ-30 и др.) с длиной волны излучения 253-265 им.