Уплотнение

Уплотнение материала, необходимое для приготовления срезов, производится путем пропитывания предварительно обезвоженного материала парафином, целлоидином, органическими смолами. Более быстрое уплотнение достигается применением метода замораживания кусочков, например, в жидкой углекислоте

Заливка: помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин на 1-2 ч при 52-56 °С. Дают парафину, остывая, затвердеть; вырезают из него блок с заключённым образцом и закрепляют на деревянном кубике. Также используют заливку в смолы, желатин и замораживание.

После окончательного пропитывания объекта его заливают расплавленным парафином, специально приготовленным для этих целей и хранящимся в термостате.

В качестве формочек для заливки используют разнообразные приспособления. Г-образные гладкие угольники изготовляют из металла (латунь, свинец, сталь). Рекомендуется применять угольники, длинная сторона которых равна 8—10 см, короткая — 3 см, высота — 1, 5—2 см.

Угольники кладут на отполированную металлическую или стеклянную пластину и, сдвигая углы, создают формочку нужных размеров.

Заключение срезов

Гистологическая техника, комплекс методич. приёмов, используемых в гистологии и патол. анатомии при изготовлении препаратов клеток, тканей и органов для их последующего микроскопирования. Приготовление постоянных гистол. препаратов в виде тонких срезов состоит из след. осн. этапов: фиксации, промывки, обезвоживания и заливки кусочков, приготовления срезов, окрашивания, обезвоживания и заключения. Фиксация — сохранение структуры и в нек-рой степени химич. состава клеток и тканей путём быстрого воздействия на них химич. или физич. агентов, предотвращающих развитие посмертных изменений. Для фиксации используют р-ры формальдегида (4%-ные), глютаральдегида (2—6%-ные), фиксирующие смеси, содержащие уксусную к-ту (жидкость Карнуа), пикриновую к-ту (жидкость Буэна).

Один из лучших фиксаторов, используемый в электронномикроскопич. исследованиях, — р-р четырёхокиси осмия. При применении медленно проникающих фиксаторов (четырёхокись осмия, глютаральдегид) толщина кусочков тканей должна быть не более 2 мм. Наилучшие результаты даётотносительно длительная фиксация при t 2—4 °С. Обызвествлённые ткани и структуры после фиксации подвергают декальцинации - обработке к-тами (азотной, соляной и др.) или электрич. током. По окончании фиксации кусочки промывают в воде или спирте. Дальнейшая обработка заключается в придании кусочкам однородной плотной консистенции, что необходимо для получения тонких срезов. Это достигается либо путём замораживания кусочков, либо путём пропитывания — заливки их различными застывающими средами. При изготовлении срезов на замораживающем микротоме (рис. 1) замораживание объектов достигается либо жидкой углекислотой, либо с помощью термоэлектрич. охлаждающего столика ТОС. В микротоме-криостате МК-25 (рис. 2) имеется камера с низкой темп-рой, в к-рую заключён микротом.

Из сред для заливки чаще применяют парафин и целлоидин.При заливке в парафин отмытую от фиксатора ткань обезвоживают (через спирты возрастающей крепости), проводят через промежуточный растворитель (ксилол или хлороформ) и пропитывают парафином при t 55—56°С, затем, быстро охлаждая кусочки, получают парафиновые блоки. При заливке в целлоидин промежуточным растворителем является спирт — эфир (1: 1). Для получения срезов с парафиновых и целлоидиновых блоков используют санный микротом (рис. 3). Окрашиванием срезов достигают контрастирования различных структур клеток и тканей, по-разному воспринимающих те или иные красители.

Окрашивают срезы после удаления из них парафина (ксилолом), проводки их через спирты понижающейся концентрации и промывания в воде. Способы окрашивания препаратов многообразны. Из основных красителей чаще используют гематоксилин, кармин, сафранин, метиловый зелёный, галлоцианин; из кислых — эозин, эритрозин, кислый фуксин, индигокармин и др. Спец. красители выделяют определённые компоненты клеток и тканей, напр, слизь окрашивается муцикармином, эластич. элементы — орсеином и др. Для приготовления препаратов нервной ткани применяют суправитальную окраску метиленовым синим и различные методы импрегнации — восстановление нервными структурами металлов, гл. обр. серебра. После окраски хорошо промытые препараты обезвоживают в спиртах восходящей крепости (до 100%), просветляют в смеси карболовой к-ты и ксилола (1: 3), выдерживают в 2 порциях ксилола и затем заключают в среду, обеспечивающую сохранность структур объекта, его окраску и прозрачность (рис. 4), применяя для этого канадский или пихтовый бальзам, полистирол и др.

В случаях, когда препарат нельзя приводить в контакт с ксилолом, спиртом, используют для заключения водорастворимые среды (глицерин, желатин или их смеси). Для изучения свежего материала (живых или переживающих объектов) изготовляют временные гистол. препараты, в к-рых объект заключают в физиол. р-ры. Большие возможности для прижизненного исследования клеток даёт метод культуры тканей.