Направление репликации ДНК. Образование репликативной вилки. Точка ori.

Сделанный Мезельсоном и Сталем вывод был полностью подтвержден и для других объектов, включая животных и высшие растения. Вместе с тем, оставалось неясным, в каком направлении происходит репликация ДНК и какие ферменты обеспечивют этот процесс. Ответ на первый вопрос удалось получить Дж. Кэрнсу (1963) в опытах на E. Coli. Он поставил своей задачей сделать процесс репликации ДНк видимым, для чего использовал метод авторадиографии. Этот метод позволяет обнаруживать и локализовывать радиоактивную метку, включающуюся в молекулы ДНК, РНК, либо белка путем их помещения на чувствительную к радиации фотоэмульсию. Днк можно специфично метить если выращивать клетки с тимидином, являющимся дезоксирибонуклеозидом тимина. Тимидин изибрательно включается в ДНк, поэтому выращивание клеток E. Coli в среде с меченым по тритию тимидином позволяет следить за распределением метки по мере ее включения во вновь сентизирующуюся ДНК. Поскольку крупные молекулы ДНК лагко разрываются при механически повреждениях, Кэрнс разработал такую технику при которой клетки разрушались ферментом лизоцимом, а ДНК из лизированных клеток собирали на мембранных фильтрах, помещаемых стекла, покрытые фотоэмульсией, чувствительной к B-частицам, выделяющимся при распаде трития. Радиоавтографы, полученные после проявления таких фотографических стекол, выдерживавшихся предварительно в темноте до образования зерен металлического серебра, показали, что хромосома E. Coli имеет кольцевидную форму и во время своей репликации образует cтруктуры в форме греческой буквы 0. Обнаружение подобных структур, являющихся формами молекул ДНК в процессе их репликации, показывало, что раскручивание двух

комплементарных цепей родительской ДНК и их полуконсервативная репликация происходят практически одновременно и начинаются в общей точке начала репликации, обозначаемой как локус ori. Последующий анализ результатов опыта Кэрнса и данные других экспериментаторов, нацеленных на изучение механизма репликации ДНК у различных бактерий, фагов, плазмид, показали, что в большинстве случаев она происходит двунаправлено и начинается, как правило, от одного уникального локуса оri. В этом месте в одной из цепей ДНК разрывается фосфодиэфирная связь, обеспечивающая последующее раскручивание дуплекса и образование особых структур - репликативных вилок, движущихся в противоположных направлениях по кольцевой ДНК. Следует, однако, отметить, что в ДНК эукариот, как правило, обнаруживается не один, а множество локусов оri, что, по-видимому, служит необходимым условием для того, чтобы громадные молекулы ДНК в хромосомах эукариот успели полностью отреплицироваться за время одного клеточного цикла.

Эксперименты, проведенные на прокариотах (Е.Coli, Т7, некоторые плазмиды), также выявили в их ДНК (скорость репликации которых составляет около 20 мкм/мин, что в 20-30 раз выше, чем у эукариот) не по одному, а по два или даже более локусов оri. Среди этих локусов наблюдается подчиненность: когда активен главный оri, остальные могут не функционировать, и, напротив, в случае выключения главного оri запасные оri обеспечивают репликацию ДНК. Очевидно, такая зависимость обеспечивает стабильность важнейшей функции ДНК - ее способности к репликации.