F-фактор

Рис. 5.2. ПеренесенняF-фактораз клітини F+ у F–

Рис. 5.3. Перенесення ДНК від клітини Hfr доF–, ДНК інтегрованогоF-факторапозначено червоним

Розділ 5. Генетика бактерій, вірусів і одноклітинних еукаріотів

Коли в клітині F– опиняється частина гомологічної ДНК іншої бактерії, починається гомологічна рекомбінація, описана в розділі 1, – обмін ділянками між донорною ДНК і ДНКклітини-реципієнта.Результуючаклітина-реципієнтзалишається гаплоїдною – " зайва" ДНК, що не потрапила до хазяйської хромосоми, піддається деградації нуклеазами, оскільки вона не є циркулярною. Таким чином, між двома бактеріальними штамами відбувається своєрідне часткове схрещування, яке можна досліджувати за допомогою звичайних методів генетичного аналізу. Розглянемо, наприклад, схрещуванняHfr-штамудикого типу за генами thr + та leu + (визначають здатність синтезувати відповідні амінокислоти), який містить також ген чутливості до стрептоміцину Str S, із штамомF–, що має ген стійкості до стрептоміцину Str R і мутантні гени thr – та leu – (ауксотрофний штам, який потребує присутності відповідних амінокислот у поживному середовищі):

Hfr, thr + leu + Str S × F–, thr – leu – Str R.

З певною частотою в такому схрещуванні утворюються рекомбінантні бактерії дикого типу F–, thr + leu + Str R, які можна відібрати, вирощуючи культуру на середовищі зі стрептоміцином.

Оскільки перенесення генів із клітини Hfr у F– відбувається послідовно, починаючи із сайта інтеграціїF-фактора(рис. 5.3), можна картувати розміщення генів у бактеріальній хромосомі (у порядку потрапляння їх до клітиниF–).Для цього кон'югацію (після змішування клітин двох типів у рідкому середовищі) зупиняють шляхом струшування пробірки через певні проміжки часу. Це дозволило свого часу отримати детальні генетичні карти бактеріальної хромосоми (відстані на таких картах вимірюють у хвилинах) і довести її циркулярність.

F-фактор, інтегрований до хромосоми, може також вирізатися з неї з утворенням автономної плазміди. Таке вирізання іноді буває неточним: ділянкаF-факторазалишається в хромосомі, замінюючись на ділянку хромосоми в складі плазміди. Утворюється так званийF'-фактор, який здатен переносити в інші клітини бактеріальні гени незалежно від бактеріальної хромосоми (явище сексдукції). Після такого перенесення можна отримати частково диплоїдні клітини – за генами, що перебувають у складіF'-фактора.Між останнім і хромосомоюклітини-реципієнтаможлива гомологічна рекомбінація, що приводить або до утворенняHfr-клітині дуплікації генів (одиночний кросинговер – вбудовуванняF'-факторау хромосому), або до обміну ділянками між хромосомою таF'-фактором(подвійний кросинговер).

БАКТЕРІОФАГИ

Бактеріофаги (бактеріальні віруси) поділяють на два типи: вірулентні, які проникають у клітину, розмножуються та зумовлюють руйнування клітини (літичний шлях), і помірні – такі, що можуть використовувати або літичний шлях, або шлях лізогенії, коли ДНК фага за допомогоюсайт-специфічноїрекомбінації (див. наступний підрозділ) вбудовується в бактеріальний геном (фаг перетворюється на профаг). В останньому випадку за несприятливих для бактерії умов може відбуватися індукція бактеріофага – перехід до літичного шляху.

Процес перенесення генетичного матеріалу між бактеріальними клітинами за рахунок активності бактеріофагів називають трансдукцією. Здійснюють її зазвичай помірні бактеріофаги: після практично необмеженого існування фагової ДНК у бактеріальному геномі, індукція іноді зумовлює вирізання фагової ДНК разом із бактеріальними ділянками. Далі відбувається реплікація цієї ДНК, синтез білків оболонки бактеріофага (закодованих у генах фагової ДНК) і збирання фагових частинок. Фагові частинки потім інфікують інші клітини, і якщо реалізується шлях лізогенії, вбудовуються в ДНКклітини-хазяїнаразом із захопленими раніше бактеріальними генами. До помірних фагів належать, зокрема, фаги Р1, Р22, λ (див. нижче огляд життєвого циклу фагаλ). ДНК помірних фагів може розглядатися як частина бактеріального геному, яка іноді виходить з під контролю: гени бактеріофага жодним чином не відрізняються від бактеріальних, тобто перебувають під контролем промоторів, що впізнаються бактеріальноюРНК-полімеразоюклітини-хазяїна.

Бактеріофаги групи Т відносять до таких, що реалізують тільки літичний шлях. Як і для помірних фагів, їхній геном представлений однією лінійною дволанцюговою ДНК. ДНК Т-парнихфагів (Т2, Т4, Т6) містить приблизно 200 тис. пар основ, фагові гени кодують білки системи реплікації (у тому числі й власнуДНК-полімеразу), білки фагової оболонки та певні регуляторні білки, що сприяють перемиканню роботи клітинних систем на користь бактеріофага. Після проникнення ДНК у клітину починається транскрипція групи фагових генів бактеріальноюРНК-полімеразою, згодом – реплікація фагової ДНК, синтез фагових білків, збирання частинок бактеріофага й лізис клітини.

Аналогічно реалізується літичний шлях Т-непарнимифагами (Т1, Т3, Т5, Т7), ДНК яких є трохи меншою за розміром (~40 тис. пар основ). Відразу після проникнення ДНК уклітину-хазяїнавідбувається експресія гена мономерної фаговоїРНК-полімерази, яка далі ефективно транскрибує інші гени бактеріофага.

Бактеріальні клітини мають свою систему захисту від ДНК бактеріофагів. Основою цієї своєрідної " імунної системи" є рестриктази – велика група специфічних нуклеаз, які розрізають лише певні невеличкі (частіше чотири або шість нуклеотидів) елементи послідовності. Активність рестриктази залежить від метилювання певних азотистих основ у складі специфічних сайтів рестрикції: сайти у складі бактеріальної ДНК є метильованими й тому непомітними для рестриктази, неметильовані сайти ДНК бактеріофага залишаються чутливими.

Крім фагів, котрі містять дволанцюгову ДНК як генетичний матеріал, існують ще дві групи фагів, геном яких є відхиленням від " канону". Перша група – бактеріофаги з одноланцюговою циркулярною ДНК (φ Х-174, М13). Ця ДНК досить маленька, фагові гени кодують тільки10–12білків. Наприклад, геном (який був першим із прочитаних)φ Х-174(слід читати" фі-десять")побудований надзвичайно економно: десять генів (один із них – ген А – дає дві різні молекули РНК при транскрипції) займають практично всю циркулярну ДНК бактеріофага (рис. 5.4). Більш того, декілька генів перекриваються за рахунок використання різних рамок зчитування: гени А і С та С і D перекриваються своїми кінцями, гени B, K і E повністю містяться в межах інших генів; три гени – А, С і K – використовують усі три можливі рамки зчитування на одній ділянці ДНК (звичайно, у даному випадку всі три рамки є відкритими). Явище перекриття генів за рахунок використання різних рамок зчитування спостерігається також для кількох інших бактеріофагів і зустрічається в еукаріотів.

У бактеріальній клітині фагова ДНК, що позначається як(+)-ланцюг, використовується як матриця для синтезу(–)-ланцюга.У результаті утворюється дволанцюгова циркулярна ДНК, з неї транскрибуються гени((–)-ланцюгє матричним), і вона, після одноланцюгового розриву в(+)-ланцюзі, використовується для реплікації за типом кільця, що котиться (див. рис. 5.2): на циркулярному(–)-ланцюзісинтезується велика кількість копій(+)-ланцюга, фрагменти нарізаються, замикаються в кільце й упаковуються у фагову оболонку.

Генетика

J

848-964

B K

A* 5075-5151-221

E

568-843

F

1001-2284

H

2931-3917

G

2395-2922

Рис. 5.4. Геном бактеріофагаφ Х-174.Позначено початок та кінець кожного гена, загальна довжина ДНК – 5386 пар основ

Остання група бактеріофагів (R17, F2, MS2) містить як генетичний матеріал молекулу РНК, де є тільки чотири гени (фагова РНК одночасно слугує як мРНК), що кодують: РНК-залежнуРНК-полімеразу, яка здійснює копіювання фагової РНК; два білки оболонки; білок, що забезпечує лізис клітини. Таким чином, ці найменші з усіх відомих вірусів здійснюють найпростіший шлях передачі спадкової інформації – тільки з РНК на РНК і на білок.

САЙТ-СПЕЦИФІЧНАРЕКОМБІНАЦІЯ

Як приклад сайт-специфічноїрекомбінації розглянемо уже згадану інсерцію (інтеграцію) ДНК бактеріофагаλ в бактеріальну хромосому. У складі фагової ДНК є сайт attP – ділянка довжиною 270 пар основ, у складі бактеріальної ДНК – сайт attВ (23 пари основ). Обидва сайти мають ділянку спільної (або гомологічної) послідовності довжиною 15 пар основ. Два білки – бактеріальний IHF (I ntegration H ost F actor) і продукт одного з генів бактеріофага інтеграза – зв'язуються з цими сайтами (рис. 5.5).

Розділ 5. Генетика бактерій, вірусів і одноклітинних еукаріотів