![]() Главная страница Случайная страница КАТЕГОРИИ: АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника |
Семейства рекомбиназ.
До настоящего времени было открыто только два класса сайт-специфических рекомбиназ: инвертаза/резолвазное семейство, (так же называемое сериновым семейством), и λ интегразное семейство, (так же называемое тирозиновым семейством) (Stark W.M., Boocock M.R., 1995; Johnson R.C., 1995). Для некоторых членов этих двух семейств были детально изучены организация рекомбинационного комплекса, активного центра рекомбиназы, химического механизма обмена цепями. Согласно новой наменклатуре семейства интеграз различаются по типу химических реакций, используемых ими во время рекомбинации: семейства используют, соответственно, серин или тирозин, которые находятся в активных центрах рекомбиназ, как расщепляющие нуклеофилы при разрезании ДНК. Основные рекомбинационные реакции серинового и тирозинового семейств показаны на Рисунке 1.7.
Рисунок 1.7. Консервативная сайт-специфическая рекомбинация. А. Реакция для сериновой рекомбиназы. Б. Реакция для тирозиновой рекомбиназы. L и R – левые и правые концы молекул. Круглые и острые края стрелок обозначают, соответственно, 5’ и 3’ концы ДНК нитей.
Для обоих семейств химическая стадия реакции происходит в ядрах рекомбинационных сайтов, которые довольно похожи между собой по своей организации. Сериновые рекомбиназы, в основном, связываются со своими сайтами как димеры (Smith M.C., Thorpe H.M., 2002). В отличие от сериновых рекомбиназ, тирозиновые рекомбиназы связывают ДНК как мономеры (Nunes-Duby S.E. et al, 1998), после чего устанавливается сильное взаимодействие между мономерами. В редких случаях, как например, в случае XerC/XerD системы, рекомбинационный сайт имеет в своем составе связывающие последовательности для двух разных субъединиц рекомбиназы, называемых XerC и XerD белками. Активная рекомбиназа состоит из двух субъединиц, работающих согласованно. Рекомбинационная реакция происходит в пределах двух центральных сайтов, и четыре субъединицы соединяются вместе в синаптическом комплексе с фиксированной геометрией. Типичная сериновая рекомбиназа производит согласованные двойные разрывы ДНК, образуя 5’-фосфосериновую связь и смежную с ней 3’-гидроксильную группу на каждой цепи. На следующем этапе, согласно модели обмена цепями, гидролизованный рекомбинационный комплекс разворачивается на 180° по горизонтальной оси с переносом цепей ДНК. После чего 3’-гидроксильные группы взаимодействуют с 5’-о-сериновыми фосфодиэфирными связями, что позволяет сохранить ДНК цепи в рекомбинантном состоянии и освободить рекомбиназу от ковалентных связей с ДНК. Если рекомбинационные сайты ориентированы «голова к голове», что необходимо для инвертаз, то происходит инверсия фрагмента между рекомбинационными сайтами. Если сайты расположены в ориентации «голова к хвосту», что обязательно для действия резолваз, то происходит делеция фрагмента ДНК между рекомбинационными сайтами. Сериновые рекомбиназы подразделяются на малые и большие сериновые рекомбиназы. Небольшая часть малых сериновых рекомбиназ, называемых инвертазами, распознает разнонаправленные рекомбинационные сайты и осуществляет инверсию фрагмента ДНК во время рекомбинации, а основная часть малых сериновых рекомбиназ распознает сонаправленные рекомбинационные сайты и производит вырезание ДНК. Большие сериновые рекомбиназы активируют интеграцию. В основном большие сериновые рекомбиназы обнаружены в фагах и транспозонах грамм-положительных бактерий. Среди членов серинового семейства наиболее изученными являются резолвазы γ δ и Tn3 транспозонов, инвертазы Hin и Gin из Salmonella и бактериофага Mu, соответственно (Johnson R.C., 1991; van de Putte P., Goosen N., 1992; Grindley N.D.F., 1994). В отличие от сериновой рекомбиназы, тирозиновая рекомбиназа вносит единичный разрыв на любой цепи ДНК в рекомбинационных партнерах, используя в активном центре тирозин как расщепляющий нуклеофил. В результате этой реакции образуются 3’-о-фосфотирозиновая связь и 5’-гидроксильная группа. Взаимодействие гидроксильной группы с фосфотирозиновой связью приводит к формированию структур Холлидея. Реорганизация рекомбинационного комплекса (или гидролиз структур Холлидея), происходящая в результате разрыва/сшивки второй пары цепей ДНК, завершает рекомбинацию. Наиболее хорошо охарактеризованными тирозиновыми рекомбиназами являются: Int белок фага λ, который способствует интеграции и эксцизии фагового генома из хозяйской хромосомы; Cre интеграза фага P1, роль которой заключается в поддержании фагового генома в виде мономера (единичной копии плазмиды в лизогенном состоянии); Flp интеграза, которая контролирует копийность 2-микронной дрожжевой плазмиды за счет инверсии ДНК сегмента во время репликации; разрешающие хромосомные димеры белки XerC/XerD большинства прокариот (Chen Y. et al, 2000; Van Duyne G.D., 2001. Biswas T. et al, 2005). Основные рекомбиназы обоих семейств представлены в Таблице 1.
Таблица 1. Сайт-специфическая рекомбинация: ферменты и их функции.
|