Методы, используемые в биотехнологическом производстве

Методы хранения посевного материала. При промышленном культивировании клеток в биореакторах идет про­цесс постепенного вытеснения менее приспособленных форм более приспособ­ленными, часто менее продуктивными по отношению к вырабатываемым веще­ствам. Он получил название автоселекции. В связи с этим встает проблема длительного хранения клеток без утраты ценных свойств. Это возможно, если резко затормозить все протекающие в них жизненные процессы. Существуют следую­щие методы хранения.

1. Лиофильное высушивание (обезвоживание после замораживания при температуре -40~60°С и ниже). Применяется в отношении продуцентов антибио­тиков. а) Высушивание на воздухе в стерильной среде (на почве, бумаге, дис­ках агар-агара и т.д.). б) Сохранение спор (пригоден для спорообразующих бактерий рода Вacilus). в) Криоконсервация - глубокое замораживание клеток с их последую­щим хранением в жидком азоте (- 196°С) или в парах азота (- 155°С).

Значительные трудности представляет поддержание сред, оборудования, воздуха в стерильном состоянии. Это необходимо для исключения попадания в биоректоры посторонних микроорганизмов.

Клетки лучше сохраняют свои свойства при создании щадящих условий в биореакторе, приближенных к условиям в лабораторном культиваторе.

2. Выделение целевого продукта. Это завершающая стадия биотехнологического процесса. Продукт может накапливаться в клетке или выделятся в культуральную жидкость. Наибо­лее сложно выделение продукта, накапливающегося в клетках. Для этого клетки необходимо отделить от культуральной жидкости, разрушить, затем целевой продукт очистить от массы компонентов разрушенных клеток.

Первым этапом на пути к очистке целевого продукта является отде­ление биомассы от культуральной жидкости - сепарация.

Виды сепарации:

1. Флотация. Если клетки продуцента в биореакторе из-за низкой смачи­ваемости накапливаются в поверхностных слоях жидкости, то жидкость предва­рительно вспенивают, затем отделяют ее верхний слой с клетками. Флотаторы различных конструкций сцеживают, откачивают или соскребают пену, состоя­щую из пузырьков газа с прилипшими к ним клетками. Флотацию широко ис­пользуют как первый этап отделения дрожжевой массы для осветления культу­ральной жидкости.

2. Фильтрация - задержание биомассы на пористой фильтрующей пе­регородке. Применяют фильтры однократного или многократно использования: барабанные, дисковые, ленточные, тарельчатые, карусельные, вакуум-фильтры, фильтр-прессы различных конструкций, мембранные фильтры. Диаметр пор мо­жет превышать размеры клеток. Иногда биомассу сдувают с поверхности фильт­ра сжатым воздухом или срезают специальным ножом.

3. Центрифугирование - осаждение взвешенных в жидкости частиц с применением центробежной силы. Требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование. Поэтому оно оправдывает себя, если: а) суспензия фильтрует­ся медленно; б) поставлена задача максимального освобождения культуральной жидкости от содержащихся частиц; в) необходимо наладить непрерывный про­цесс сепарации в условиях, когда фильтры рассчитаны только на периодическое действие.

Центрифугирование и фильтрация иногда реализуются в комбинации, в фильтрационных центрифугах. Перспективны для осаждения биомассы центрифуги-сеператоры, в которых биомасса оседает на стенках вращаемого цилиндра или на тарелках специальной тарельчатой вставки.

Вторым этапом приполучении продукта, накапливающегося в клет­ках, является разрушение клеток, которое проводят физическим, химическим и химико-ферментативным методами.

Физическое разрушение проводят ультразвуком, с помощью вращаю­щихся лопастей или вибраторов, встряхиванием со стеклянными бусами, продавливанием под высоким давлением через узкое отверстие, раздавливанием замо­роженной массы, растиранием в струнке, осмотическим шоком, замораживанием - оттаиванием, сжатием с последующим резким снижением давления. Этим спо­собам дезинтеграции клеток присуща определенная не избирательность: обработ­ка может отрицательно влиять на качество получаемого продукта. Физические методы позволяют целенаправленно выделять какую-либо одну фракцию внут­риклеточного содержимого.

Химическое и химико-ферментативное разрушение клеток избира­тельно, не всегда пригодно. Его проводят обработкой клеток толуолом или бутанолом при промышленном получении дрожжевого автолизата и ряда ферментов. Эффективный лизис клеток вызывают антибио­тики полимиксины, тироцидины. новобиоцин, нистатин и другие, некоторые по­верхностно-активные вещества, а также глицин.

Разрушенные клеточные стенки отделяют методами сепарации. В боль­шинстве биотехнологических процессов клеточные стенки отбрасывают как бал­ласт, но возможно и промышленное получение компонентов клеточных стенок как целевого продукта.

Третий этап - выделение целевого продуктаиз культуральной жидко­сти или гомогената разрушенных кислот проводят путем его осаждения, экстрак­ции или адсорбции.

1. Осаждение растворенных веществ возможно физическими (нагрева­ние, охлаждение, разбавление или концентрирование раствора) или химическими методами, переводящими отделяемый продукт в малорастворимое состояние. Так, пенициллин переводят в кристаллический осадок в присутствии соединений калия или натрия. Белки осаждают добавлением сульфата аммония, органических растворителей (этанола, ацетона). Нуклеиновые кислоты осаждают с помощью полииминов, основные группы которых вступают во взаимодействие с их фосфатными группами. Современной модификацией метода является аффинное осаждение.

2. Экстракция извлечение продукта из твердого (твердо-
жидкофазная) или жидкого (жидко-жидкофазная) образца. К твердо-жидкофазной экстракции относится обливание образца водой с целью извлече­ния из него растворимых веществ, например солей металлов из руд, подвергну­тых бактериальной обработке, или растворимых продуктов из массы субстрата (соломы и т.д.) при твердофазном культивировании. Применяют органические растворители, например, при экстракции клеточной массы ацетоном, переводя­щим в раствор ряд липидных и белковых компонентов.

Жидко-жидкофазная экстракция - добавление органических растворите­лей для извлечения из культуральной жидкости антибиотиков, витаминов, каратиноидов, липидов, некоторых гидрофобных белков. Витамин В12 экстрагируют фенолом и его производными (крезол, другие алкилфенолы, галогениды). Исполь­зуют бензиловый спирт, особенно в щелочных условиях. Фосфолипиды извлека­ют путем экстракции хлороформом.

Полностью избежать нагревания, губительного для многих ценных ве­ществ, позволяют методы холодовой экстракции (криоэкстракции). Она как бы нивелирует различие между твердым субстратом и культуральной жидкостью, поскольку и то и другое находится в замороженном состоянии. Криоэкстракция осуществляется растворителями, кипящими при низких температурах и находя­щимися при комнатной температуре в газообразном состоянии. Криоэкстракция может использоваться в комбинации с криоконсервацией клеток. Урожай клеток длительное время хранится без потери свойств в условиях глубокого заморажи­вания.

3. Адсорбция - частный случай экстракции, при котором экстрагирую­щим веществом из жидкой или газовой фазы является твердое тело. Хорошими адсорбентами являются древесный уголь, глины с развитой пористой поверхно­стью. Путем адсорбции из культуральной жидкости выделяют антибиотики и ви­тамины.

К современным методам разделения веществ, основанным на принципах экстракции и адсорбции, относятся хроматография, электрофорез, изотахофорез, электрофокусировка.