Главная страница Случайная страница КАТЕГОРИИ: АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника |
Реакция агглютинации
Реакция агглютинация (РА) - это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электролита (изотонического раствора натрия хлорида). Образовавшийся осадок называют агглютинатом. Для реакции необходимы: 1. Антитела (агглютинины) - находятся в сыворотке больного или в иммунной сыворотке. 2. Антиген - взвесь живых или убитых микроорганизмов, эритроцитов или других клеток. 3. Изотонический раствор. Реакцию агглютинации для серодиагностики широко применяют при брюшном тифе, паратифах (реакция Видаля), бруцеллезе (реакция Райта) и др. Антителом при этом является сыворотка больного, а антигеном - известный микроб. При идентификации микробов или других клеток антигеном служит их взвесь, а антителом - известная иммунная сыворотка. Эту реакцию широко применяют при диагностике кишечных инфекций, коклюша и др. Подготовка ингредиентов: 1) получение сыворотки см. с. 200; 2) приготовление антигена. Взвесь живых микробов должна быть гомогенной и соответствовать (в 1 мл) примерно 30 ед. мутности по оптическому стандарту ГИСК. Для ее приготовления обычно используют 24-часовую культуру, выращенную на скошенном агаре. Культуру смывают 3-4 мл изотонического раствора, переносят в стерильную пробирку, определяют ее густоту и, если нужно, разводят. Применение взвеси убитых микробов - диагностикумов - облегчает работу и делает ее безопасной. Обычно пользуются диагностикумами, приготовленными на производстве. Постановка реакции. Существует два метода проведения этой реакции: реакция агглютинации на стекле (иногда ее называют ориентировочной) и развернутая реакция агглютинации (в пробирках). Реакция агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стекло наносят 2 капли специфической (адсорбированной) сыворотки и каплю изотонического раствора. Неадсорбированные сыворотки предварительно разводят в соотношении 1: 5 - 1: 25. Капли на стекло наносят так, чтобы между ними было расстояние. Восковым карандашом на стекле помечают, где какая капля. Культуру петлей или пипеткой тщательно растирают на стекле, а потом вносят в каплю изотонического раствора и в одну из капель сыворотки, размешивая в каждой до образования гомогенной взвеси. Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является контролем сыворотки. Внимание! Нельзя переносить культуру из сыворотки в каплю изотонического раствора, которая является контролем антигена. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 мин. Контроль сыворотки должен оставаться прозрачным, а в контроле антигена должна наблюдаться равномерная муть. Если в капле, где культура смешана с сывороткой, появятся хлопья агглютината на фоне прозрачной жидкости, результат реакции считают положительным. При отрицательном результате реакции в капле будет равномерная муть, как в контроле антигена. Реакция отчетливее видна, если ее рассматривать на темном фоне в проходящем свете. При ее изучении можно пользоваться лупой. Развернутая реакция агглютинации. Готовят последовательные, чаще всего двукратные разведения сыворотки. Сыворотку больного обычно разводят от 1: 50 до 1: 1600, иммунную - до титра или до половины титра. Титр агглютинирующей сыворотки - ее максимальное разведение, в котором она агглютинирует гомологичные клетки. Разведение сыворотки: 1) ставят в штатив нужное количество пробирок одинакового диаметра, высоты и конфигурации дна; 2) на каждой пробирке указывают степень разведения сыворотки, кроме того, на 1-й пробирке пишут номер опыта или название антигена. На пробирках контролей пишут " КС" - контроль сыворотки и " КА" - контроль антигена; 3) во все пробирки наливают по 1 мл изотонического раствора; 4) в отдельной пробирке готовят исходное (рабочее) разведение сыворотки. Например, для приготовления рабочего разведения 1: 50, в пробирку наливают 4, 9 мл изотонического раствора и 0, 1 мл сыворотки. На пробирке обязательно указывают степень ее разведения. Исходное разведение сыворотки вносят в первые две пробирки и в пробирку контроля сыворотки; 5) готовят последовательные двукратные разведения сыворотки. Примерная схема ее разведения приведена в табл. 16. Примечание. Стрелки указывают перенос жидкости из пробирки в пробирку; из 5-й пробирки и пробирки контроля сыворотки 1, 0 мл выливают в дезинфицирующий раствор. Внимание! Во всех пробирках должен быть одинаковый объем жидкости. После того как сделаны разведения сыворотки, во все пробирки, кроме контроля сыворотки, вносят по 1-2 капли антигена (диагностикума или свежеприготовленной взвеси бактерий). В пробирках при этом должна появиться небольшая равномерная муть. Контроль сыворотки остается прозрачным. Пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат (37° С). Предварительный учет результатов реакции производят через 2 ч, а окончательный - спустя 18-20 ч (выдерживая при комнатной температуре). Учет результатов как всегда начинают с контролей. Контроль сыворотки должен оставаться прозрачным, контроль антигена - равномерно мутным. Просматривают пробирки в проходящем свете (очень удобно на темном фоне) невооруженным глазом, с помощью лупы или агглютиноскопа. Агглютиноскоп - прибор, состоящий из полой металлической трубки, укрепленной на подставке. Сверху на ней расположен окуляр с регулирующим винтом. Под трубкой прикреплено вращающееся зеркало. Пробирку с изучаемой жидкостью вставляют сбоку в отверстие трубки на такое расстояние, чтобы находящаяся в ней жидкость была под окуляром. Установив с помощью зеркала освещение и сфокусировав окуляр, определяют наличие и характер агглютината. При положительном результате реакции в пробирках видны зерна или хлопья агглютината. Агглютинат постепенно оседает на дно в виде " зонтика", а жидкость над осадком просветляется (сравните с равномерно мутным контролем антигена). Для изучения величины и характера осадка содержимое пробирок слегка встряхивают. Различают мелкозернистую и хлопьевидную агглютинацию. Мелкозернистая (О-агглютинация) получается при работе с О-сыворотками*. Хлопьевидная (Н) - при взаимодействии подвижных микроорганизмов со жгутиковыми Н-сыворотками. * (О-сыворотки содержат антитела к О (соматическому)-антигену, Н-сыворотки - к жгутиковому.) Хлопьевидная агглютинация наступает быстрее, образующийся при этом осадок очень рыхлый и легко разбивается. Интенсивность реакции выражают следующим образом: ++++ все клетки осели, жидкость в пробирке совершенно прозрачна. Результат реакции резко положительный. +++ осадок меньше, нет полного просветления жидкости. Результат реакции положительный. ++ осадок еще меньше, жидкость мутная. Результат реакции слабо положительный. + незначительный осадок, жидкость мутная. Сомнительный результат реакции. - осадка нет, жидкость равномерно мутная, как в контроле антигена. Отрицательный результат реакции. Возможные ошибки при постановке реакции агглютинации. 1. Спонтанная (самопроизвольная) агглютинация. Некоторые клетки, особенно микробы в R-форме, не дают однородной (гомогенной) взвеси, быстро выпадают в осадок. Во избежание этого следует пользоваться культурой в S-форме, которая не дает спонтанной агглютинации. 2. В сыворотке здоровых людей имеются антитела к некоторым микроорганизмам (так называемые " нормальные антитела"). Титр их невысок. Поэтому положительный результат реакции в разведении 1: 100 и выше говорит о ее специфичности. 3. Групповая реакция с близкими по антигенному строению микробами. Например, сыворотка больного брюшным тифом может также агглютинировать бактерии паратифа А и Б. В отличие от специфической групповая реакция идет в более низких титрах. Адсорбированные сыворотки не дают групповой реакции. 4. Следует учесть, что специфические антитела после перенесенной болезни и даже после прививок могут сохраняться длительное время. Они называются " анамнестическими". Чтобы отличить их от " инфекционных" антител, образующихся в течение текущей болезни, реакцию ставят в динамике, т. е. исследуют сыворотку больного, взятую повторно через 5-7 дней. Повышение титра антител говорит о наличии болезни - титр " анамнестических" антител не повышается, а может даже снизиться. Контрольные вопросы 1. Что такое реакции иммунитета, каковы их основные свойства? 2. Какие компоненты участвуют в серологических реакциях? Почему реакции называют серологическими, из скольких фаз они состоят? 3. Что такое реакция агглютинации? Ее использование и методы проведения. Что такое диагностикум? 4. Каким антигеном пользуются при исследовании сыворотки больного? Какой сывороткой определяют вид неизвестного микроба? 5. Что такое О- и Н-агглютинация? В каких случаях образуется хлопьевидный осадок и когда мелкозернистый?
|