Метод исследования в свете люминесценции

Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. В оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Один из них помещают перед конденсором. Он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, который установлен после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен — возбуждение свечения препарата не является простым отражением света). Его часто используют совместно с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Такое многообразие применений объясняется очень высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне. Кроме того, информация о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения, имеет огромную ценность.

ИЗУЧЕНИЕ УСТРОЙСТВА МИКРОСКОПА ИЗМЕРЕНИЕ ВЕЛИЧИНЫ МИКРОСКОПИРУЕМОГО ОБЪЕКТА.

Микроскоп – оптический прибор, предназначенный для получения увеличенных изображений малых объектов, невидимых невооруженным глазом. Нормальный глаз человека на расстоянии наилучшего зрения (25 см) может различить мелкую структуру, состоящую из линий или точек при условии, что они находятся друг от друга на расстоянии не меньше 0, 07 мм. Размеры же бактерий, органических клеток, мелких кристаллов и т.д. значительно меньше этой величины. Для обнаружения и изучения таких объектов используются типы микроскопов. Оптическая схема микроскопа состоит из двух частей: объектива и окуляр (рис 1). Объектив представляет систему короткофокусных линз, которая предназначена для ослабления сферической и хроматической аберрации. Окуляр микроскопа состоит из нескольких линз. Ход лучей в микроскопе показан на рис 2. На рисунке 1 изображен общий вид. Его главные части: основание, коробка с микрометрическим механизмом 9, предметный столик 10, револьвер 11 с объективами 5, конденсор 2 и окуляр 7.

Оптическая схема состоит из 2 частей: осветительной и наблюдательной. В осветительную часть входит: зеркало 1, конденсатор с ирисовой диафрагмой 3 и объемный светофильтр 4. В наблюдательную – объектив, призам 6 и окуляр, соединненые в тубусе микроскопа.

Рассматриваемый объект АВ, помещенный вблизи главного фокуса объектива образует за объективом действительное, обратное, увеличенное изображение , расположенное между фокусом и оптическим центром Ок окуляра. При рассмотрении этого изображения в окуляр, как в лупу, оно будет еще более увеличенным, мнимым и прямым. В конечном счете микроскоп дает изображение А₂В₂, которое является обратным по отношению к предмету АВ. Линейное увеличение микроскопа равно произведению увеличений, даваемых объективом и окуляром:

(1)

Увеличение микроскопа не может быть сколь угодно большим, и его значение не превышает 3000. Это связано с ограниченной разрешающей способностью микроскопа, обусловленной дифракционными явлениями, как изображение любого предмета есть результат дифракции и интерференции рассеянного объектом света. Разрешающей способностью называют свойства оптической системы давать раздельное изображение двух близко расположенных светящихся или освещенных точек объекта (элемента структуры). Разрешающую способность принято измерять величиной:

R = 1/ (2)

где - предел разрешения, т.е. наименьшее возможное расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно.

Применяя это понятие к условиям микроскопирования биологических объектов, можно считать, что предел разрешения обуславливает наименьшую величину тех структурных деталей, которые могут различаться в препарате. Как видно из формулы (2), разрешающая способность микроскопа тем больше, чем меньше его предел разрешения.

Теоретически доказано, что предел разрешения можно определить по формуле (3),

где - длина волны света, n – показатель преломления среды, между предметом и объективом и объективом, – апертурный угол, т.е. угол, образованный крайними лучами, попадающими в объектив.

Произведение: n – sin () - называют угловой апертурой.

Очевидно, чем выше разрешающая способность, тем более мелкие детали можно рассмотреть. Повышение разрешающей способности оптического микроскопа достигается уменьшением длины волны света, с помощью которого производится исследование, например, путем применения ультрафиолетового излучения (для этого применяется специальный микроскоп) и увеличением числовой апертуры микроскопа. Для чего необходимо:

1. Использовать иммерсионный объектив, у которого пространство между наблюдаемым предметом и входной линзой заполняется жидкостью с показателем преломления близким показателю преломления стекла. (воздух n = I, глицерин n = 1, 45, кедровое масло n = 1, 51).

2. Использовать объектив с большим апертурным углом. Величина апертурного угла указана на объективе. Например, увеличение = 8, то апертурный угол равен 0, 2.

7. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ.

1. Познакомьтесь с главными частями микроскопа.

2. Подготовьте к работе осветительную часть микроскопа: установите тубус микроскопа в удобное для наблюдения положение и закрепите винтом. Схема объектива производится поворотом пистолета до фиксированного положения.

3. Подготовьте к работе осветительную часть: наблюдая в окуляр, установите зеркало так, чтобы отраженный луч светофильтра прошел через светофильтр, диафрагму, конденсатор, исследуемый объект (камера Горяева, рис.3) и попал в объектив. Диафрагму установите так, чтобы освещаемое поле было не очень ярким.

4. Занесите в таблицу основные характеристики объективов и окуляров: заводской номер, увеличение, числовую апертуру.

5. Определите увеличение микроскопа для каждого объектива окуляра.

ИЗМЕРЕНИЕ ВЕЛИЧИНЫ МИКРОСКОПИРУЕМОГО ОБЪЕКТА.

Величину микроскопируемого объекта можно определить при помощи окулярного микрометра, который представляет собой короткую шкалу (или сетку) с делениями от 0, 1 мм, нанесенную на круглую стеклянную пластинку. Он помещается между линзами окуляра так, чтобы шкала находилась в одной плоскости с изображением предмета. В этом случае при рассматривании изображения в окуляр микроскопа, шкала и изображение будут совмещены.

Пусть изображение объекта, рассматриваемого в микроскоп, имеет длину равную n делениям окулярного микрометра. Если бы со шкалой совпадал сам предмет, то его длина была бы равна 0, 1 n мм, т.к. деление шкалы равно 0, 1 мм. Но со шкалой совпадает не сам предмет, а его изображение, увеличенное объективом в раз. Поэтому истинная L длина предмета будет в N раз меньше длины изображения.

Отсюда:

ЗАДАНИЕ.

1. Определите размеры большого и малого квадратов камеры Горяева (рис.4), используя объективы с увеличениями 8 и 40.

2. Используя объективы с увеличением 8 и 40, определите размеры эритроцитов крови лягушки.

ФОРМА ОТЧЕТА.

N п/п	Увеличение Объектива	Цена деления окулярного микрометра.	Микроскопируемый объект.	Величина изображения	Величина микроскопируемого объекта
	Стороны квадратов камеры Горяева
		0, 1 мм	Большого Малого
		0, 1 мм	Большого Малого
	Диаметры эритроцита
		0, 1 мм	Большой малый
		0, 1 мм	Большой Малый