Реакция иммунофлюоресценции

Имеются два варианта постановки (РИФ): прямая и непрямая (рис. 8). Прямая РИФ — простая реакция, но для ее постановки требуется большое количество меченых антимикробных сывороток. Непрямая РИФ — более сложная реакция, но поставить ее можно имея только одну меченую сыворотку. При этом антиген вначале обрабатывают обычной иммунной специфической сывороткой, а затем к иммунному комплексу антиген — антитело прибавляют меченную флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) антисыворотку к антителу этого комплекса. Обычно индикация антигена (микроба) на первом этапе проводится иммунной кроличьей сывороткой, тогда на втором этапе используется меченная ФИТЦ антикроличья сыворотка, полученная путем иммунизации гамма-глобулинами кроликов, ослов или других животных.

Рис. 8. Реакция иммунофлюоресценции:

а — прямая; 6 — непрямая

Постановка прямой РИФ: на обезжиренном предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки, а из органов и тканей — мазки-отпечатки. Их подсушивают, фиксируют, наносят на мазки взятую в рабочем разведении люминесцирующую сыворотку и помещают во влажную камеру при температуре 37 °С на 20-30 мин. Затем, чтобы удалить избыток флюоресцирующих антител, их промывают (10—15 мин) в забуференном изотоническом растворе хлорида натрия с последующим ополаскиванием (10 мин) в дистиллированной или проточной воде. Сушат препараты при комнатной температуре. Исследуют в люминесцентном микроскопе с использованием иммерсионного объектива. Интенсивность флюоресценции в виде зеленого ободка вокруг бактерий оценивают по четырехбалльной шкале: «++++» — очень яркая; «+++» — яркая; «++» —выраженная о6одочная флюоресценция; «+» — слабое свечение клеток.