Показатели цитокинового статуса

4. Перерисуйте в рабочую тетрадь схему специфического связывания клетки с МКАТ и окрашивания антителами, меченными ФИТЦ. Отметьте на рисунке-схеме элементы, соответствующие цифрам 1, 2, 3, 4

		1

5. Перерисуйте в рабочую тетрадь схему фагоцитоза. Отметьте на рисунке-схеме сегментоядерный нейтрофил, частицы латекса.

6. Перерисуйте в рабочую тетрадь табл.4

Таблица 4

Показатели иммунного статуса здоровых жителей Чувашии

(по Карзаковой Л.М., 2005)

Примечание: * - предел колебаний включает значения интервала Р₂₅ – Р ₇₅ (нижний квартиль – верхний квартиль)

7. Перерисуйте в рабочую тетрадь фракции клеток после их разделения в результате центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина

Эталоны ответов на тест-вопросы для самостоятельной подготовки и контроля

1.

· Подсчет числа лейкоцитов в камере Горяева или с использованием гемоанализатора;

· исследование лейкоформулы при окраске мазков крови азур-эозином;

· определение процентного и абсолютного числа Т-, В-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов методом прямой или непрямой иммунофлюоресценции с использованием МКАТ CD3, CD20, CD4, CD8;

· определение в сыворотке крови концентрации основных трех классов Ig – IgM, IgG, IgA в реакции радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини;

· исследование фагоцитарной активности нейтрофилов в латекс-тесте с определением фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа;

· определение концентрации ЦИК в сыворотке крови методом осаждения полиэтиленгликолем (Mm 6000).

2.

· Исследование функциональной активности Т-лимфоцитов в реакции ФГА-индуцированной лимфопролиферации;

· определение экспрессии активационных маркеров CD25, CD71, DR, CD95 на мононуклеарных клетках;

· исследование подклассов иммуноглобулинов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 в сыворотке крови в реакции Манчини.

3. В случае обнаружения клинических признаков приобретенной иммунологической недостаточности.

4.

· Число Т-лимфоцитов (CD3⁺);

· число Т-хелперов (CD4⁺) и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8⁺);

· индекс стимуляции в ФГА-индуцированной лимфопролиферации;

· уровни спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-2, ИФН-γ, ФНОα в куль

туре лимфоцитов.

5.

· Число В-лимфоцитов (CD19⁺ или CD20⁺);

· концентрация IgM, IgG, IgA в сыворотке крови;

· исследование пролиферативной активности лимфоцитов на В-клеточный митоген (митоген лаконоса, полисахариды);

· уровни спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10 в культуре лимфоцитов;

· определение секреторного IgA.

6.

· Исследование фагоцитарной активности нейтрофилов или макрофагов в латекс-тесте;

· бактерицидная активность по НСТ-тесту.

· уточняющие тесты: интенсивность хемотаксиса (миграции) фагоцитов, исследование адгезивной способности нейтрофилов к пластику.

7. ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, ИФН-γ, ФНОα.

8. Иммунофенотипирование мононуклеарных клеток проводят с помощью МКАТ, конъюгированных с флуоресцирующим красителем (прямая реакция поверхностной иммунофлуоресценции), либо при помощи немеченых МКАТ, которые затем взаимодействуют с овечьими (или кроличьими) антителами против Ig мыши, меченными флуорохромами (непрямой метод иммунофлуоресценции). Непрямой метод более чувствителен по сравнению с прямым методом иммунофлуоресценции, в связи с чем он предпочтителен для иммунофенотипирования клеток.

Этапы реакции непрямого метода иммунофлуоресценции:

· выделение мононуклеарных клеток из периферической крови центрифугированием в фиколл-верографиновом градиенте;

· инкубация мононуклеаров (0, 1х10⁶ кл в 50 мкл) с 5 мкл тестируемого МКАТ в течение 30-45 мин при +4˚ С;

· после отмывки в растворе Хенкса клетки инкубируют 30мин при +4˚ С с 50 мкл флуоресцеина изотиоцианата (ФИТЦ) меченных овечьих антител к Ig мыши, разведенных 1: 100;

· затем клетки дважды отмывают в растворе Хенкса, к осадку добавляют 50 мкл 1% параформальдегида;

· после этого клетки просматривают под иммерсией на флуоресцентном микроскопе.

9. Реакция радиальной иммунодиффузии в геле.

10. ИФА.

11. Исследуемая сыворотка вносится в две пробирки – опытную и контрольную. В опытную пробирку наливают раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ), в контрольную – буферный раствор. ПЭГ связывает ЦИК, что приводит к повышению оптической плотности опытной сыворотки. По разнице оптической плотности опытной и контрольной сывороток судят о концентрации ЦИК в исследуемой сыворотке.

12. ИФА.

13. ФГА-индуцированная пролиферация лимфоцитов (РБТЛ).

14.

· Выделение мононуклеарных клеток в градиенте плотности фиколла верографина в стерильных условиях;

· взвесь мононуклеаров культивируют в 150 мкл «полной культуральной

среды» (среды RPMI-1640, содержащей 10 % инактивированную

эмбриональную телячью сыворотку или сыворотку человека АВ(IV) группы, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES буфера, 40 мкг/мл гентамицина) в 96-луночных круглодонных планшетах при 37˚ С в атмосфере 5 % СО₂ в течение 72 ч в присутствии митогена – фитогемагглютинина (ФГА, 5 мкг/мл). В качестве контроля используют клетки, инкубированные без ФГА;

· за 6-8 час до окончания инкубации в культуру лимфоцитов добавляют тимидин, меченный радиоактивным изотопом ³Н, в концентрации 1 мкКи на лунку;

· по завершении реакции взвесь лимфоцитов переносят на стекловолоконные фильтры, промывают раствором этилового спирта и трихлоруксусной кислоты;

· высушенные в течение ночи фильтры переносят в флаконы со стинтилляционной жидкостью и размещают в конвеере жидкостного β -счетчика для регистрации импульсов излучения, испускаемого ³Н-тимидином, включившимся в массу накопившихся в процессе митотического деления лимфоцитов;

· высчитывают средние арифметические величины числа импульсов в контрольных культурах со средой (спонтанная бласттрансформация) и культурах с ФГА (ФГА-индуцированная лимфопролиферация), определяют индекс стимуляции как отношение числа импульсов в опытных культурах лимфоцитов (стимулированных ФГА) к таковому в контрольных культурах (без ФГА).

15.

· Фагоцитарный индекс;

· фагоцитарное число;

· процент НСТ-позитивных фагоцитов.

16. НСТ-тест.

17.

· Радиоиммунологический анализ;

· иммуноферментный анализ;

· электрохемилюминесцентный метод;

· цепная полимеразная реакция.

18. МКАТ секретируются одним клоном антителообразующих клеток, узко специфичны в отношении отдельной антигенной детерминанты (эпитопа), в то время как поликлональные антитела продуцируются различными клонами антителообразующих клеток в ответ на стимуляцию поликлональными стимуляторами. В организме в обычных условиях в ответ на естественные антигены как правило продуцируются поликлональные антитела.

19. Как отношение числа CD4⁺-клеток к числу CD8⁺-клеток (норме 1, 5-2, 5).

20. Исследование экспрессии Fas-рецептора апоптоза на мононуклеарных клетках, определение уровня каспаз и экспрессии их генов, морфологическое исследование клеток с помощью люминесцентных красителей.

21. CD25.

22.CD71, HLA-DR.

23. ИЛ-1, ИФН-γ, ФНОα, ИЛ-8

24. ИЛ-4, ИЛ-10

25. ИФН-γ, ФНОα

26. CD95

27.

· Использование лазерного проточного цитометра;

· использование люминесцентного микроскопа.

28. «Кластер дифференцировки» (cluster of differentiation) обозначает молекулы, имеющиеся на поверхности клеток, которые могут быть идентифицированы при помощи определенной группы моноклональных антител.