Геном бактерий

Геном бактерий включает несколько тысяч генов, расположенных линейно на макромолекуле ДНК, называемой хромосомой. У прокариот имеется одна кольцевая хромосома на клетку (за исключением организмов, у которых не произошло деление и образовались, например, нитчатые формы), не отделенная' от цитоплазмы мембраной и видимая на ультратонких срезах в виде клубка нитей в светлом пространстве (нуклеоида). У эукариот нити ДНК представляют сложные образования, так же называемые хромосомами, которых может быть много на клетку. Хромосомы эукариот отделены от цитоплазмы ядерной мембраной, образуя ядро. Цитологическое различие в строении генетического аппарата является основным в разграничении прокариот и эукариот, остальные признаки служат либо дополнительными, либо коррелирующими. Помимо хромосомы, у прокариот могут присутствовать небольшие кольцевые молекулы ДНК, называемые плазмидами, которые не являются обязательными для генома данного вида. Плазмиды варьируют по величине и по численности в клетке от одной до многих десятков. Крупные плазмиды могут содержать сотни генов. Плазмиды относятся к экстрахромосомным носителям генетической информации. Нуклеиновые кислоты представляют простые молекулы в виде нити из пентоз (дезоксирибоз для ДНК и рибоз для РНК), соединенных фосфодиэфирной связью. К остаткам пентоз присоединены азотистые основания — пурины, аденин (А) и гуанин (Г), и пиримидины, цитозин (Ц) и тимин (Т). Нить может оканчиваться либо фосфатом (5' конец), либо пентозой (3 конец). Согласно правилу Чаргаффа, отношение между основаниями в ДНК строго стехиометрическое, но число пар Г + Ц или А + Т может варьировать. По числу преобладания тех или иных пар различают организмы с высоким или низким молярным содержанием ГЦ (ГЦ, моль %), величина которого обычно приводится для вида. Молекула ДНК представляет двойную нить, в которой пары оснований располагаются строго друг против друга (А: Т, Г: Ц) и связаны водородными связями, приводящими к строению молекулы в виде «двойной спирали Уотсона-Крика». Генетическая информация определяется линейным порядком расположения оснований, их последовательностью. Техническая операция установления последовательности называется секвенированием и представляет сейчас важнейший технический метод молекулярной биологии. Геном содержит исчерпывающую характеристику организма и для бактерий имеет величину п-106 пар оснований (п. о.), в типичном случае около 5 млн п. о. Общая длина хромосомы составляет примерно 1 мм и, чтобы упаковать ее в нуклео-ид размерами 0, 1-0, 5 мкм; двойная нить сворачивается определенным образом. Репликация ДНК представляет полуконсервативный процесс, в котором дочерние клетки получают по одной нити материнской и одной нити вновь синтезированной ДНК. Репликация хромосомы начинается в участке, называемом oriC (от англ. origin), присоединением белковых факторов инициации. Это сопровождается расплетением двойной спирали ДНК с образованием двух репликативных вилок, на каждой из которых начинается встречный синтез второй нити. Для синтеза существует сложный ферментный аппарат, обеспечивающий расплетение нитей (ДНК-ги-раза или топоизомераза), хеликаза, праймаза с праймером РНК, ДНК-полимераза I и ДНК-полимераза Ш. Их комплекс получил название реплисомы (рис. 20, 21). Для ее функционирования необходимо поступление предшественников в виде праймеров РНК, в свою очередь образуемых из пентоз, оснований, АТФ — из цитоплазмы и ферментов — из рибосомального аппарата. Следующий этап представляет коррекция считывания, заключающаяся в удалении ошибочно вставленных оснований и замене их на правильные, а также модификация ряда оснований. Материнская нить ДНК имеет метилированные основания, а вновь синтезированная — нет. Коррекцию осуществляют ДНК-полимеразы I и III. Точность репликации ДНК очень высока и ошибки составляют менее 10-9. Для устранения повреждений в результате внешних воздействий, например радиационных, существуют системы репарации.

Рис.1. Реплисома (по J. Perry, J. Staley, 1997)

Образование на двойной нити кольцевой хромосомы прокариот двойной вилки включает следующие этапы: 1) — удаление тетрамеров белка Dna В с дуплекса ДНК у конца места начала репликации Ori С; 2) в месте вилки симметрично присоединяется праймаза с несколькими белками {Pri A, Pri В, Pri С, Dna T); 3, 4) праймер РНК синтезируется праймазой для каждой нити ДНК; 5) — присоединяется димерная ДНК-полимераза 111.

Рис.2. Действие реплисомы (по J. Perry, J. Staley, 1997)

Дуплекс ДНК расплетается ДНК гиразой и хеликазой. Однонитевые участки покрываются дестабилизирующими SSB-белками. В промежуток добавляются прай-меры РНК. Димерная ДНК полимераза III связана с нитью скользящим затвором и добавляет нуклеотиды к 3 концу ведущей нити. К ведомой нити добавляется фрагмент Оказаки. ДНК полимераза I и ДНК-лигаза удаляют праймеры, заменяя из соответствующими нуклеотидами. Наиболее общим механизмом исправления ошибок служит вырезание поврежденного участка и репарация пробела комплементарно сохранившейся нити. Эндонуклеаза гидролизует фосфатные связи на несущей мутацию нити, а затем ДНК-полимераза I восстанавливает пробел. Распознавание поврежденных участков осуществляет SOS-система, вступающая в действие, когда вилка репликации попадает на поврежденное место.

Для ряда бактерий, преимущественно патогенных, составлены полные кольцевые карты ДНК с указанием расположения на них генов. Наиболее подробно изучена Escherichia coli, с которой сравнивают обычно все остальные бактерии. Важ1ю отметить, что последовательности нуклеотидов дают точную характеристику вида организма для его идентификации, сравнимую с номером паспорта, но содержащую также и всю функциональную информацию, которую, однако, нужно уметь прочитать. Одной из важнейших функций клетки служит защита от инородной информации. Для этого клетка обладает мощной и очень активной ДНКазой, гидролизующей инородную ДНК, не находящуюся в клетке в виде кольцевых молекул. Обмен генетической информацией предполагает обходные пути для преодоления этого барьера.

Рис. 3. Схема реакции молекулярной гибридизации для обнаружения в образцах ДНК или РНК возбудителя специфическим меченным зондом. (Иммунология инфекционного процесса. Под ред. В.И. Покровского, С.П. Гордиенко и В.И. Литвинова.-М., 1994.)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на многократном увеличении числа копий (амплификации) определенного участка ДНК, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой (рис. 5). ПЦР - это очень чувствительный метод, теоретически для получения результата достаточно наличие в материале одной молекулы ДНК. ПЦР состоит из трех основных этапов: подготовки исследуемой пробы (изоляция ДНК или РНК), собственно ПЦР и детекции продукта ПЦР (амплифицированной ДНК). При использовании РНК в качестве матриц для ПЦР предварительно на этой РНК-матрице посредством фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы или ревертазы) синтезируют комплементарную ДНК, которая затем используется в качестве матрицы в ПЦР. После того, как из бактерий Thermous thermophilis удалось получить ДНК-полимеразу, которая наряду с полимеразной обладает еще и обратно-транскриптазной активностью, удалось совместить эти две реакции. Этот вариант ПЦР широко применяется для детекции РНК-содержащих вирусов, определения экспрессии вирусных, бактериальных и клеточных генов по их РНК.
Для проведения ПЦР необходимы пять основных компонентов:

• фермент ДНК-полимераза;
• пара олигонуклеотидных праймеров;
• набор нуклеотидов;
• копируемая ДНК;
• ионы Mg ⁺², необходимые для функционирования ДНК-полимеразы.

Рис. 4. Схема полимеразной цепной реакции. дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат (Из: Schaechter M., Medoff G., Eisenstein B. Mechanisms of microbial diseases, 2 nd ed., Williams & Wilkins, 1993).

Для амплификации (т.е. синтеза ДНК-матрицы) отбирают наиболее консервативную часть, уникальный ген. Для запуска синтеза на ДНК-матрице используют 2 праймера (короткие, длиной 20-30 оснований одноцепочечные фрагменты ДНК), комплементарные 3 ¢ -концам ДНК искомого гена. Выделенную из исследуемого материала ДНК нагревают. При этом ДНК распадается на две нити. Добавляют праймеры, затем смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры при наличии в смеси ДНК искомого гена связываются с его комплементарными участками (отжиг). Добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. При температуре, оптимальной для функционирования ДНК-полимеразы, нуклеотиды присоединяются к 3' -концам праймеров, формируется специфический фрагмент (ампликон). После этого цикл повторяют снова, при этом количество ДНК гена будет увеличиваться каждый раз в 2 раза. Рассчитано, что за 30-40 циклов из одной матрицы можно получить 10 ⁸ ампликонов. Реакцию проводят в специальных приборах - амплификаторах. После 30-80 циклов накопления копий ДНК проводят их идентификацию методом гель-электрофореза и визуализацию в УФ свете после окрашивания этидием бромида. Для подтверждения принадлежности ДНК возбудителю можно провести ДНК-гибридизацию.

Заключение

Микроорганизмы служат излюбленными объектами для решения общих вопросов генетики, биохимии, биофизики, космической биологии и др. Культуры бактерий применяются для количественного определения аминокислот, витаминов, антибиотиков. Плодородие почв в значительной мере связано с жизнедеятельностью бактерии, минерализующих растительные и животные остатки с образованием соединений, усваиваемых с.-х. растениями. Вместе с тем, синтезируя живое вещество клеток, бактерии накапливают большие количества органических соединений в почве. В верхних слоях окультуренной почвы на площади в 1 га содержится несколько тонн бактериальных клеток. Живущие в почве азотфиксирующие бактерии обогащают почву азотом. Исключительно велика роль клубеньковых бактерий, фиксирующих газообразный азот. Заражение семян бобовых растений нитрагином — препаратом, содержащим клетки клубеньковых бактерий, повышает урожай растений и накопление азота в почве. С помощью бактерий, сбраживающих пектиновые вещества, осуществляют мочку льна, конопли, кенафа и других лубяных культур. Разные виды бактерии применяют при получении из молока кисломолочных продуктов, масла и сыра.

Список литературы

1. Н. М. Мандро, Н. Е. Землянская, В. В. Бондаренко, В. В. Бурик - ОСНОВЫ ОБЩЕЙ МИКРОБИОЛОГИИ, ВИРУСОЛОГИИ И БОЛЕЗНИ ЗВЕРЕЙ И ПТИЦ.

2. В. Н. Сойфер, Э.Р. Пилле, О. Г. Газенко, Л.В. Крушинский, С. Я.

3. Залкинд и др. " История биологии с начала XX века до наших дней" М. 1975.

4. Земсков М.В. и др. - Основы общей микробиологии, вирусологии и иммунологии. Изд. 2-е, испр. и доп. М., «Колос», 1977.

5. https://032.help-rus-student.ru/text/002.htm

6. https://www.o-med.ru/083.php

7. https://collegemicrob.narod.ru/microbilogy.