Среды Гисса. принципы их конструирования. Оценка результатов роста бактерий на средах Гисса.

Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и — в некоторых случаях — для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности пользуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзоферментов можно определить при помощи дифференциально-диагностических сред.

Для многих микроорганизмов таксономическим признаком служит способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продуктов. Для выявления этого используют среды Гисса, содержащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу и др.). Для обнаружения кислот в среду добавлен реактив Андреде, который изменяет свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7, 2—6, 5, поэтому набор сред Гисса с ростом микроорганизмов называют «пестрым рядом».

Генетика микроорганизмов

1.Ядерный аппарат у бактерий и его особенности. Механизм репликаиии бактериальной хромосомы.

Генетическая система бактерий имеет по крайней мере четыре особенности, присущие только этим организмам.

1. Хромосомы бактерий (и соответственно плазмид) располагаются свободно в цитоплазме, не отграничены от нее никакими мембранами, но связаны с определенными рецепторами на цитоплазматической мембране. Поскольку длина хромосомы (у Е. соli около 1, 6 мм) во много раз превышает длину бактериальной клетки (1, 5—3, 0 мкм в среднем), хромосома особым компактным образом в ней упакована: молекула хромосомной ДНК находится в суперспирализованной форме и свернута в виде петель, число которых составляет 12—80 на хромосому. Петли в центре нуклеоида объединяются за счет связывания ДНК с сердцевинной структурой, представленной молекулами особого класса РНК — 4, 55 РНК. Такая упорядоченная упаковка обеспечивает постоянную транскрипцию отдельных оперонов хромосомы и не препятствует ее репликации. Возможно, что петли упакованной хромосомы способствуют компартментализации рибосом.

2. Хотя бактерии являются гаплоидными организмами, т. е. имеют один набор генов, содержание ДНК у них непостоянно, оно может при благоприятных условиях достигать значений, эквивалентных по массе 2, 4, 6 и даже 8 хромосомам. У всех прочих живых существ содержание ДНК постоянное, и оно удваивается (кроме вирусов и плазмид) перед делением.

3. У бактерий в естественных условиях передача генетической информации происходит не только по вертикали, т. е. от родительской клетки дочерним, но и по горизонтали с помощью различных механизмов: конъюгации, сексдукции, трансдукции, трансформации.

4. У бактерий очень часто помимо хромосомного генома имеется дополнительный плазмидный геном, наделяющий их важными биологическими свойствами, нередко — специфическим (приобретенным) иммунитетом к различным антибиотикам и другим химиопрепаратам.

Содержание ДНК у бактерий зависит от условий их роста: при благоприятных условиях оно возрастает до величин, соответствующих массе нескольких хромосом. Это уникальное свойство бактериального генома. Биологическое значение его состоит в том, что, регулируя содержание копий своих генов (а оно будет опре деляться количеством копий синтезируемых хромосом), бактерии одновременно приспосабливают скорость своего размножения к условиям роста. Наряду с увеличением содержания ДНК у бактерий в этом случае существенно возрастает и количество рибосом. Благодаря этому создаются необходимые условия для транскрипции и трансляции (а у бактерий они происходят одновременно) нескольких копий генов одновременно, возрастает суммарная скорость биосинтеза всех субклеточных и клеточных структур и соответственно скорость размножения бактерий. Время клеточного цикла бактерий сокращается от нескольких часов до 20—30 мин. Скорость размножения определяет возможность накопления в окружающей среде большого запаса клеток данного вида. Это и является причиной существования бактерий в природе многие миллионы лет. Возможность регулировать скорость собственного размножения — одно из главных условий, обеспечивающих выживание бактерий в окружающей среде, а следовательно, и сохранение вида в природе.

Репликация ДНК у бактерий начинается со строго фиксированного сайта хромосомы — оriС. Он включает в себя участки с так называемыми ДНК-боксами и расположенными между ними короткими последова-тельностями. Оба элемента примыкают к гену dnaА. Это и служит сигналом для действия ДНК-хеликазы. Репликация имеет полуконсервативный характер, идет одновременно в двух направлениях и заканчивается также в строго фиксированной точке - terminus. Поскольку цепи ДНК антипараллельны (если одна нить начинается с 5'-конца, другая — с З'-конца), а ДНК-полимераза III осуществляет синтез ДНК только в направлении 5'> 3', репликация происходит своеобразно: на одной из расплетенных нитей — «прямой», или лидерной, или ведущей, — она идет непрерывно, а на другой — отстающей — ДНК-полимераза III должна возвращаться, чтобы наращивать нить тоже в направлении 5'> 3', прерывисто, через образование сегментов Оказаки, длиной у бактерий около 1000 нуклеотидов (у эукариот - около 200—300 нуклеотидов).

2. Бактериальная хромосома, ее упаковка в клетке. Формы обмена генетическим материалом у бактерий: конъюгация, трансформация, трансдукция, трансфекция и сексдукция.

Бактериальная хромосома представлена одной двухцепочечной молекулой ДНК кольцевой формы. Размеры бактериальной хромосомы у различных представителей царства Procaryotae варьируют. Бактериальная хромосома формирует компактный нуклеоид бактериальной клетки. Бактериальная хромосома имеет гаплоидный набор генов. Она кодирует жизненно важные для бактериальной клетки функции.

Плазмиды бактерий представляют собой двухцепочечные молекулы ДНК. Они кодируют не основные для жизнедеятельности бактериальной клетки функции, но придающие бактерии преимущества при попадании в неблагоприятные условия существования.

Помимо основного механизма передачи генов — по наследству (по вертикали), у бактерий существуют следующие формы обмена генетическим материалом по горизонтали, т. е. между отдельными особями в популяции клеток: трансформация, трансфекция, трансдукция, конъюгация и сексдукция.

1.Трансформация — перенос генетического материала, заключающийся в том, что бактерия-реципиент захватывает (поглощает) из внешней среды фрагменты чужеродной ДНК. Трансформация может быть спонтанной или индуцированной. Индуцированная (искусственно получаемая) трансформация происходит при добавлении к культуре бактерий очищенной ДНК, полученной из культур тех бактерий, генетические признаки которых стремятся передать исследуемой культуре. Спонтанная трансформация происходит в естественных условиях и проявляется в возникновении рекомбинантов при смешивании генетически различающихся клеток. Она протекает за счет ДНК, выделяющейся клетками в окружающую среду вслед-ствие их лизиса или в результате активного выделения ДНК жизнеспособными клетками-донорами.

2.Трансфекция — вариант трансформации бактериальных клеток, лишенных клеточной стенки, осуществляемый вирусной (фаговой) нуклеиновой кислотой. С помощью трансфекции удается вызвать у таких бактерий (без клеточной стенки) вирусную инфекцию. Трансфекцию можно осуществить и с другими (не бактериальными) клетками, если ввести в них чужеродную ДНК, способную рекомбинировать с ДНК этих клеток, или воспроизводить вирионы, или самостоятельно реплицироваться.

3.Трансдукция — перенос генетического материала от клетки-донора клетке-реципиенту с помощью бактериофагов. Различают трансдукцию неспецифическую и специфическую.

Неспецифическая трансдукция — случайный перенос фрагментов ДНК от одной бактериальной клетки к другой.

Специфическая трансдукция осуществляется только умеренными фагами, обладающими способностью включаться в строго определенные участки хромосомы бактериальной клетки и трансдуцировать определенные гены.

4.Конъюгация — это процесс обмена генетическим материалом (хромосомным и плазмидным), осуществляемый при непосредственном контакте клеток донора и реципиента. Процесс контролируется только конъюгативными плазмидами, имеющими совокупность генов, называемую tra-опероном. Этот оперон контролирует синтез аппарата переноса, конъюгативную репликацию и явление поверхностного исключения. Аппаратом переноса являются специальные донорные ворсинки, с помощью которых устанавливается контакт между конъюгирующими клетками.

5.Сексдукция — перенос генетического материала между бактериальными клетками, осуществляемый F-плазмидой с помощью механизма, аналогичного специфической транcдукции.

3. Конъюгативный механизм обмена генетическим материалом у бактерий. F-плазмиды, их роль, функции tra-оперона.

Конъюгация — это процесс обмена генетическим материалом (хромосомным и плазмидным), осуществляемый при непосредственном контакте клеток донора и реципиента. Процесс контролируется только конъюгативными плазмидами, имеющими совокупность генов, называемую tra-опероном. Этот оперон контролирует синтез аппарата переноса, конъюгативную репликацию и явление поверхностного исключения.

Процесс конъюгации протекает через следующие стадии: установление контакта между донором и реципиентом, протаскивание нити ДНК от донора к реципиенту, достройка перенесенной нити ДНК комплементарной ей нитью в реципиентной клетке и рекомбинация между переданной хромосомой (ее фрагментами) и хромосомой клетки-реципиента, размножение мерозиготы и образование клеток, несущих признаки донора и реципиента.

Конъюгативная репликация переносимой нити хромосомной или плазмидной ДНК осуществляется также под контролем плазмидных генов. Классическим примером конъюгативной плазмиды является половой фактор, или F-плазмида. Эта плазмида представляет собой двунитевую кольцевидную молекулу ДНК, состоящую из 94, 5 тыс. п. н.

Главная функция этой плазмиды — контроль конъюгации у бактерий кишечной группы. Ее tra-оперон содержит больше тридцати генов, которые контролируют процесс конъюгации. Эта плазмида может как находиться в автономном состоянии, так и интегрироваться в хромосому клетки. Находясь в автономном состоянии, она контролирует только собственный перенос, при котором F-клетка (клетка, лишенная F-плазмиды) превращается в F-клетку (клетку, содержащую F-плазмиду).

5. Понятие о генотипе и фенотипе микроба. Категории изменчивости: наследственно закрепленная и фенотипическая. Мутации индуцированные и спонтанные. Молекулярные механизмы мутаций. Транспозируемые элементы и их роль в эволюции. Свойства микроорганизмов, как и любых других организмов, определяются их генотипом, т.е. совокупностью генов данной особи. Термин «геном» в отношении микроорганизмов — почти синоним понятия «генотип».

Фенотип представляет собой результат взаимодействия между генотипом и окружающей средой, т. е. проявление генотипа в конкретных условиях обитания. Фенотип микроорганизмов хотя и зависит от окружающей среды, но контролируется генотипом, так как характер и степень возможных для данной клетки стенотипических изменений определяются набором генов, каждый из которых представлен определенным участком молекулы ДНК.

В основе изменчивости лежит либо изменение реакции генотипа на факторы окружающей среды, либо изменение самого генотипа в результате мутации генов или их рекомбинации. В связи с этим фенотипическую изменчивость подразделяют на наследственную и ненаследственную.

Ненаследственная (средовая, модификационная) изменчивость обусловлена влиянием внутри- и внеклеточных факторов на проявление генотипа. При устранении фактора, вызвавшего модификацию, данные изменения исчезают.

Наследственная (генотипическая) изменчивость, связанная с мутациями, — мутационная изменчивость. Основу мутации составляют изменения последовательности нуклеотидов в ДНК, полная или частичная их утрата, т. е. происходит структурная перестройка генов, проявляющаяся фенотипически в виде измененного признака.

Наследственная изменчивость, связанная с рекомбинациями, называется рекомбинационной изменчивостью.

Под мутацией подразумеваются стабильные наследуемые изменения в генотипе, проявляющиеся фенотинически в виде измененного признака. Основу мутации составляют качественные или количественные изменения последовательности нуклеотидов в ДНК, которые могут возникать при жизнедеятельности бактерий под влиянием эндогенных факторов или при действии химических и физических мутагенов.

Различают так называемые спонтанные мутации, под которыми понимают мутации, причины возникновения которых неизвестны. Частота спонтанных мутаций мала.

При искусственном же воздействии различных физических и химических мутагенов частота мутаций возрастает, — эти мутации принято называть индуцированными.

Подвижные генетические элементы.

В состав бактериального генома, как в бактериальную хромосому, так и в плазмиды, входят подвижные генетические элементы. К подвижным генетическим элементам относятся вставочные последовательности и транспозоны.

Вставочные (инсерционные) последовательности IS-элементы — это участки ДНК, способные как целое перемещаться из одного участка репликона в другой, а также между репликонами. Они содержат лишь те гены, которые необходимы для их собственного перемещения — транспозиции: ген, кодирующий фермент транспозазу, обеспечивающую процесс исключения IS-элемента из ДНК и его интеграцию в новый локус, и ген, детерминирующий синтез репрессора, который регулирует весь процесс перемещения.

Отличительной особенностью IS-элементов является наличие на концах вставочной последовательности инвертированных повторов. Эти инвертированные повторы узнает фермент транспозаза. Транспозаза осуществляет одноцепочечные разрывы цепей ДНК, расположенных по обе стороны от подвижного элемента. Оригинальная копия IS-элемента остается на прежнем месте, а ее реплицированный дупликат перемещается на новый участок.

Перемещение подвижных генетических элементов принято называть репликативной или незаконной рекомбинацией. Однако в отличие от бактериальной хромосомы и плазмид подвижные генетические элементы не являются самостоятельными репликонами, так как их репликация — составной элемент репликации ДНК репликона, в составе которого они находятся.

Известно несколько разновидностей IS-элементов, которые различаются по размерам и по типам и количеству инвертированных повторов.

Транспозоны — это сегменты ДНК, обладающие теми же свойствами, что и IS-элементы, но имеющие структурные гены, т. е. гены, обеспечивающие синтез молекул, обладающих специфическим биологическим свойством, например токсичностью, или обеспечивающих устойчивость к антибиотикам.

Перемещаясь по репликону или между репликонами, подвижные генетические элементы вызывают:

1. Инактивацию генов тех участков ДНК, куда они, переместившись, встраиваются.

2. Образование повреждений генетического материала.

3. Слияние репликонов, т. е. встраивание плазмиды в хромосому.

4. Распространение генов в популяции бактерий, что может приводить к изменению биологических свойств популяции, смене возбудителей инфекционных заболеваний, а также способствует эволюционным процес-сам среди микробов.

Изменения бактериального генома, а следовательно, и свойств бактерий могут происходить в результате мутаций и рекомбинаций.

6. Плазмиды бактерий. Определение понятия. Классы плазмид. Характеристика R-плазмид, их значение, распространение среди бактерий.

Плазмиды — наипростейшие организмы, лишенные обологки, собственных систем синтеза белка и мобилизации энергии и представляющие собой особый класс абсолютных внутриклетогных паразитов, наделяющих своих бактерий-хозяев полезными для них свойствами. Плазмиды способны автономно копироваться (реплицироваться) и существовать в цитоплазме клетки, поэтому в клетке может быть несколько копий плазмид. Плазмиды могут включаться (интегрировать) в хромосому и реплицироваться вместе с ней. Различают трансмиссивные и нетрансмиссивные плазмиды. Трансмиссивные (конъюгативные) плазмиды могут передаваться из одной бактерии в другую.

Плазмиды несут гены, не обязательные для клетки-хозяина, придают бактериям дополнительные свойства, которые в определенных условиях окружающей среды обеспечивают их временные преимущества по сравнению с бесплазмидными бактериями.

Некоторые плазмиды находятся под строгим контролем. Это означает, что их репликация сопряжена с репликацией хромосомы так, что в каждой бактериальной клетке присутствует одна или, по крайней мере, несколько копий плазмид.

У бактерий различных видов обнаружены R-плазмиды, несущие гены, ответственные за множественную устойчивость к лекарственным препаратам — антибиотикам, сульфаниламидам и др., F-плазмиды, или половой фактор бактерий, определяющий их способность к конъюгации и образованию половых пилей, Ent-плазмиды, детерминирующие продукцию энтеротоксина.

Плазмиды могут определять вирулентность бактерий, например возбудителей чумы, столбняка, способность почвенных бактерий использовать необычные источники углерода, контролировать синтез белковых антибиотикоподобных веществ — бактериоцинов, детерминируемых плазмидами бактериоциногении, и т. д. Существование множества других плазмид у микроорганизмов позволяет полагать, что аналогичные структуры широко распространены у самых разнообразных микроорганизмов.

Классификация плазмид по свойствам, которыми они наделяют своих носителей

1) F-плазмиды- донорные функции

2) R-плазмиды- устойчивость к лекарственным препаратам

3) Соl-плазмиды- синтез колицинов

4) Еnt-плазмиды- синтез энтеротоксинов

5) Нlу-плазмиды- Синтез гемолизинов

6) Биодеградативные плазмиды- разрушение различных органических и неорганических соединений, в том числе содержащих тяжелые металлы

7) Криптические плазмиды -неизвестны

В условиях широкого применения антибиотиков и других химиопрепаратов происходит естественный отбор тех штаммов патогенных бактерий, которые являются носителями R-плазмид. Среди них формируются новые эпидемические клоны патогенных бактерий. В настоящее время они играют ведущую роль в эпидемиологии инфекционных болезней, и от их распространения во многом зависит эффективность антибиотико- и химиотерапии, а в итоге — здоровье и жизнь людей.

Лекарственная устойчивость микробов. Генетические и биохимические основы устойчивости бактерий к антибиотикам. Конъюгативные и неконъюгативные R-плазмиды, их основные свойства, механизмы передачи и значение.

--Биохимические основы устойчивости. Инактивация препарата бактериальными ферментами. Некоторые бактерии способны продуцировать особые ферменты, которые делают препараты неактивными (например, бета-лактамазы, аминогликозид-модифицирующие ферменты, хлорамфениколацетилтрансфераза). Бета-лактамазы — это ферменты, разрушающие бета-лактамное кольцо с образованием неактивных соединений. Гены, кодирующие эти ферменты, широко распространены среди бактерий и могут быть как в составе хромосомы, так и в составе плазмиды.

Для борьбы с инактивирующим действием бета-лактамаз используют вещества — ингибиторы (например, клавулановую кислоту, сульбактам, тазобактам). Эти вещества содержат в своем составе бета-лактамное кольцо и способны связываться с бета-лактамазами, предотвращая их разрушительное действие на бета-лактамы. При этом собственная антибактериальная активность таких ингибиторов низкая. Клавулановая кислота ингибирует большинство известныхбета-лактамаз. Ее комбинируют с пеницил-линами: амоксициллином, тикарциллином, пиперациллином.

Предупредить развитие антибиотикорезистентности у бактерий практически невозможно, но необходимо использовать антимикробные препараты таким образом, чтобы не способствовать развитию и рас-пространению устойчивости (в частности, применять антибиотики строго по показаниям, избегать их использования с профилактической целью, через 10—15 дней ан-тибиотикотерапии менять препарат, по возможности использовать препараты узкого спектра действия, ограниченно применять антибиотики в ветеринарии и не использовать их как фактор роста).

--Генетические основы приобретенной резистентности. Устойчивость к антибиотикам определяется и поддерживается генами резистентности (r-генами) и условиями, способствующими их распространению в микробных популяциях. Приобретенная лекарственная устойчивость может возникать и распространяться в популяции бактерий в результате:

• мутаций в хромосоме бактериальной клетки с последующей селекцией (т. е. отбором) мутантов.

• переноса трансмиссивных плазмид резистентности (R-плазмид).

• переноса транспозонов, несущих r-гены

Различают трансмиссивные и нетрансмиссивные плазмиды. Трансмиссивные (конъюгативные) плазмиды могут передаваться из одной бактерии в другую.

Существует несколько генетических механизмов переноса плазмид между бактериальными клетками:

а) путем трансформации;

б) с помощью трансдуцирующих фагов;

в) путем мобилизации на перенос с помощью конъюгативных плазмид;

г) с помощью механизма самопереноса, контролируемого системой генов, объединенных в tга-оперон.

В условиях широкого применения антибиотиков и других химиопрепаратов происходит естественный отбор тех штаммов патогенных бактерий, которые являются носителями R-плазмид. Среди них формируются новые эпидемические клоны патогенных бактерий. В настоящее время они играют ведущую роль в эпидемиологии инфекционных болезней, и от их распространения во многом зависит эффективность антибиотико- и химиотерапии, а в итоге — здоровье и жизнь людей.

Пути и способы проникновения патогенных микробов в организм человека. Динамика развития инфекционного процесса, периоды. Бактерионосительство и его значение.Пути заражения человека

Заражение человека патогенными микроорганизмами может произойти только через поврежденную кожу и слизистые оболочки глаза, дыхательных, пищеварительных и мочеполовых путей. Заражение через неповрежденную кожу происходит исключительно редко, так как кожа для большинства микроорганизмов трудно проницаема. Однако даже самые ничтожные повреждения ее (укус насекомого, укол иглой, микротравмы и т. п.) могут стать причиной заражения. Место проникновения возбудителя в организм человека или животного называется входными воротами инфекции. В случае, если ими является слизистая оболочка, возможны три типа инфекции: размножение возбудителя на поверхности эпителиальных клеток; проникновение его в клетки с последующим внутриклеточным размножением; проникновение возбудителя через клетки и распространение его по организму.

Способы заражения

Заражение человека происходит одним из следующих способов:

1. Воздушно-капельным или воздушно-пылевым.

2. Фекально-оральным. Возбудитель выделяется с испражнениями или мочой, заражение происходит через рот при употреблении инфицированных пищевых продуктов или воды.

3. Трансмиссивным, т. е. через укусы кровососущих членистоногих.

4. Контактным — прямой контакт с больным, реконвалесцентом, бактерионосителем или через загрязненные предметы обихода, т. е. непрямым контактом.

5. Половым путем.

6. При использовании нестерильных медицинских приборов, особенно шприцев и т. п.

7. Вертикальным, т. е. от матери ребенку через плаценту, во время родов или сразу после них.

Динамика развития инфекционной болезни.

1. Инкубационный период — период от момента заражения до появления первых признаков заболевания.

2. Продромальный период, или период предвестников. Он характеризуется обычно неспецифическими, общими проявлениями — слабость, разбитость, головная боль, общее недомогание, повышение температуры и т. п.

3. Период развития (расцвета) болезни.

4. Период выздоровления, или реконвалесценции. Клиническое выздоровление наступает обычно раньше патологоанатомического и бактериологического выздоровления.

Бактерионосительство. Очень часто после либо латентной инфекции, либо перенесенного заболевания организм человека не в состоянии полностью освободиться от возбудителя. При этом человек, будучи практически здоровым, становится его носителем в течение многих месяцев или даже лет. Являясь источником заражения для других лиц, бактерионосители играют большую роль в эпидемиологии многих заболеваний (брюшного тифа, дифтерии и др.), поскольку они выделяют их возбудителей в окружающую среду, заражают воздух, воду, пищевые продукты. Около 5—8 % людей, переболевших брюшным тифом, становятся хроническими (на срок более 3 мес.) носителями S. typhi и служат основным их резервуаром в природе.

Учение об инфекции