Химические методы иммобилизации

К этим способам относят иммобилизацию путем ковалентного сшивания с полимерным носителем и поперечного сшивания ковалентными связями молекул белка без носителя [Грачева, Кривова. 2000], металлохелатный метод [Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж. Вудворда, 1988].

Ковалентная связь между ферментом и носителем обеспечивает высокую прочность образующегося комплекса.Недостатком метода является высокая вероятность связывания аминокислот, необходимых для проявления каталитической активности, с носителем. Поэтому иммобилизацию следует проводить в присутствии субстрата, который защищает активный центр, а носитель следует предварительно активировать [Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж. Вудворда, 1988].

Известен способ иммобилизации лакказы через ее углеводную часть на магнитных гидразидных шариках целлюлозы [Jana Rotkovaa et al., 2009] с целью исключения возможности загрязнения конечного продукта различных производств биокатализатором; на поперечно связанных магнитных хитозановых шариках[Gulay Bayramoglu et al., 2009; Jiang DS et al., 2005] для очистки сточных вод текстильного производства; на хитозане путем поперечного связывания с цианурхлоридом [Ana Cristina Franzoi et al., 2009] для применения иммобилизованного фермента в качестве биосенсора для лютеолина; на носителе Celite R-637 путем ковалентного связывания с глутаральдегидом [Leontievsky A.A. et al., 2001] с целью окисления 2, 4, 6-трихлорфенола; на целлюлозо-полиаминовых композитных волокнах и шариках, на поверхности которых содержатся первичные амины, быстро и прочно иммобилизующие фермент, с целью дальнейшего использования комплекса в качестве биокатализатора для различных процессов [Turner M.B. et al., 2005]; на углеродном волокне, используя карбодиимид/глутаральдегид для связывания лакказы с карбоксильными группами на поверхности волокна для применения иммобилизованного фермента в качестве биосенсора для фенольных соединений[Renato S. Freire et al., 2000]; на магнитном композитном материале, состоящем из Cu-тетрааминофталоцианин-Fe₃O₄, с применением глутаральдегида [Huang J. et al., 2006] с целью повышения ферментативной активности за счет изменяющихся параметров процесса.

Была изучена возможность иммобилизации лакказы на частицах полистирола, несущих активные бета-дикетоновые группы. Однако включение фермента повысило устойчивость коллоидной систем, что усложнило процессы разделения [Pich A. Et al., 2006]. Кроме того автором было отмечено, что повышенная устойчивость системы препятствует использованию в полном объеме частиц с иммобилизованным ферментом. Альтернативой данному носителю были предложены частицы гибрида PS-AAEM, оснащенные маггемитом, обладающие схожей эффективностью иммобилизации с их аналогами.

Rekuc A. с соавторами [Rekuc A. Et al., 2008] показали, что высокая стабильность и активность лакказы достигается путем ее иммобилизации на целлюлозосодержащем носителе Granocel с помощью дивинилсульфона или глутаральдегида. В ходе дальнейших исследований, направленных на оптимизацию структуры носителя с помощью изменения диаметра пор и количества функциональных групп на его поверхности, было получено, что активность фермента втрое возрастает при его иммобилизации на амино-модифицированном носителе Granocel с наибольшим размером пор и имеющем в своем составе аминогруппы.

Известен способ иммобилизации лакказы путем ее включения в шарики альгината/желатина, смешанные с полиэтиленгликолем, а затем активированные путем поперечного связывания с глутаральдегидом [Wang P. et al., 2008]. Исследования показали, что желатин и глутаральдегид, взятые в соответствующих пропорциях, увеличивают эффективность использования иммобилизованного фермента. Иммобилизация фермента проводилась с целью очистки сточных вод от токсичных красителей.

Vasil`eva с соавторами [Vasil`eva I.S. et al., 2009] описали возможность иммобилизации лакказы на карбоксиметилцеллюлозе с помощью бифункционального реагента Woodwar с целью синтеза полианилина. Исследования показали, что иммобилизованный таким способом фермент обладает высокой устойчивостью и может быть повторно использован для синтеза полимера.

Интересным также является способ иммобилизации лакказы на кристаллической силиконовой поверхности, покрытой биопленкой белков [L. De Stefano et al., 2009]. В качестве такого белка авторы предложили гидрофобин, полученный с помощью гриба Pleurotus ostreatus. Было показано, что лакказа, иммобилизованная на гидрофобине, сохраняла свою каталитическую активность.

Одним из популярных носителей, применяемых для иммобилизации лакказы методом ковалентного связывания, является диатомовая земля. Hubert Cabanaa с соавторами [Hubert Cabanaa et al., 2008] в качестве носителя для иммобилизованной лакказы использовали Celite R-633. Иммобилизация лакказы на данном носителе осуществляется путем активации его поверхности γ -аминопропилтриэтоксиланом, либо путем поперечного связывания с глутаральдегидом. Целью данных исследований была разработка биокатализатора для непрерывного удаления химикатов, разрушающих эндокринную систему.

Металлохелатный метод иммобилизации ферментов основан на способности переходных металлов образовывать хелатные комплексы c биополимерами. Данный метод не требует предварительной модификации носителя, а иммобилизация протекает достаточно быстро. Наиболее подходящими для данных целей свойствами обладают такие переходные металлы как титан и цирконий, оксиды которых нетоксичны[Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж. Вудворда, 1988]. Однако в случае использования неорганических носителей иммобилизация ферментов осуществляется скорее за счет образования слоя гидроксида металла на поверхности носителя, чем за счет химического взаимодействия между переходным металлом и носителем. Исследований по иммобилизации лакказы металлохелатным методом обнаружено не было.

Таким образом, иммобилизация лакказы является перспективным методом в направлении очистки сточных вод. Для иммобилизации данного фермента применимы практически все известные способы. Исключение составляет металлохелатный метод, данные по которому обнаружены не были.