Определение количества посевного материала, вносимого при засеве агаровыми блоками.

Количество посевного материала, вносимого при засеве носителей агаровыми блоками определями по абсолютно сухой массе мицелия, полученного путем выращивания на чашках Петри с агаризированным суслом в течении 7 суток. Агаровые блоки с определенной площадью поверхности помещали в горячую воду, а затем аккуратно отделяли мицелий от агара. Абсолютно сухую массу мицелия определяли после доведения до постоянного веса в стеклянных бюксах при температуре 105 ^оС.

Влажность биомассы определяли расчетным путем.

3. 5. Иммобилизация штамма-продуцента на различных носителях.

Иммобилизацию штамма-продуцента на различных носителях осуществляли двумя способами: качалочным и стационарным.

Для иммобилизации использовали третий пассаж.

Иммобилизацию продуцента на круговой качалке осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750мл. В качестве носителей для иммобилизации продуцента данным способом были выбраны: дубовые опилки, костра льна, сосновые стружки, растительная губка люфа, стальные губки. В боксе в стерильных условиях в зоне пламени горелки в колбы вносили 150 мл питательной среды, 0, 5% по объему посевного материала (III пассаж, 3 суток роста) и носители в количестве 50 см³, что составляло для дубовых опилок – 2 г, костры льна – 2 г, стальных губок – 6 г, люфы – 3 г, сосновые стружки – 3 г (удельная площадь поверхности составила 48, 4 см²/г).

Питательная среда имела состав согласно п.3.2. Колбы инкубировали на круговой качалке с частотой вращения 200 об/мин при температуре 32 º С в течение 10 суток.

Иммобилизацию продуцента стационарным способом осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750мл. в качестве носителей для иммобилизации продуцента данным способом были выбраны: дубовые опилки, костра льна, сосновые стружки. В боксе в стерильных условиях в зоне пламени горелки в колбы вносили 10 мл питательной среды, 20 мл посевного материала (III пассаж, 3 суток роста) и носители в количестве 100 см³, что составляло для дубовых опилок – 4 г, костры льна – 4 г, сосновые стружки – 6 г (удельная площадь поверхности составила 96, 8 см²/г).

Питательная среда имела состав согласно п.3.2. Колбы инкубировали в термостате при температуре 32 º С в течение 14 суток.

3.6. Определение активности фермента.

Для выбранного штамма-продуцента в указанных условиях культивирования экстарцеллюлярная лакказа составляет 80 % от общей оксидазной активности культуральной среды. Лакказную активность определяли по общей оксидазной активности.

Экстрацеллюлярную оксидазную активность в глубинной культуре (ОА)определяли спектрофотометрически при 410 нм с использованием пирокатехина (10^-2 М) в качестве субстрата в 0, 1 М цитратно-фосфатном буфере (рН 4, 5). Определение проводили на спектрофотометре Shimadzu UVmini1240 (Япония). В кювету, общим объемом 3 мл вносили 2 мл 0, 1 М цитратно-фосфатного буфера, 500 мкл пирокатехина (10^-2 М) и 25 мкл культурального фильтрата и определяли изменение оптической плотности раствора за 1 мин. Для расчета активности брали прямолинейный участок изменения оптической плотности, угол наклона которого к оси абсцисс составлял около 45º. В случае если угол наклона графика составлял более 45^о, объем пробы уменьшали, соответственно увеличивая объем буфера.

За единицу оксидазной активности (ЕОА ) принимали изменение оптической плотности реакционной смеси за 1 мин в пересчете на 1 мл культурального фильтрата.

Для данных условий определения активности 1 ЕОА равна 3, 38 МЕ/ мл или 5, 63·10^-8 kat.