Стадия ТП-2. Выращивание культуры в инокуляторе

Инокулятор предназначен для выращивания культуры, идущей для засева рабочего ферментера.

2.1. Подготовка инокулятора к работе.

Инокулятор представляет собой цилиндрический сосуд с геометрическим объемом 6, 3 л из нержавеющей стали с рубашкой, со сферическим днищем и крышкой (поз. ФО-10). Коэффициент заполнения аппарата – 0, 7. Аппарат оборудован турбинной мешалкой открытого типа, кольцевым барботером, пробоотборником, датчиком рН, посевным штуцером, штуцерами для подачи кислоты и щелочи. К аппарату подведены коммуникации подвода и отвода сжатого воздуха, пара, охлаждающей воды.

Освобожденный от предыдущей загрузки посевной аппарат первоначально моют водой в количестве 4 л и эту порцию, содержащую остатки культуры (0, 01% по сухому весу) направляют в сборник культуральной жидкости (поз. Сб-29). Затем вторично промывают 4 л воды, горячим 1% раствором каустической соды (со стадии ВР-2) – 5 л в течение 10 мин, горячей водой – 5 л в течение 40 мин, свежей водой - 5 л в течение 10 мин; использованный раствор каустика возвращают в сборник каустика, а промывные воды – на стадию ОБО-2.

Периодически (по графику) проводят внутренний осмотр аппарата, при котором проверяют состояние барботера и мешалки (отсутствие механических дефектов). Перед каждой операцией производят ревизию запорной арматуры, проверяют исправность приборов КИПиА.

Производят проверку герметичности системы (аппарат, индивидуальный фильтр и коммуникации) пневмометодом при давлении воздуха Р – 0, 15 МПа с помощью мыльного раствора. Устраняют обнаруженные пропуски и производят повторную проверку герметичности.

Систему считают герметичной, если падение давления в аппарате за 30 мин не превысило 0, 005 МПа.

Герметичный посевной аппарат стерилизуют текучим паром, предварительно слив воду из рубашки аппарата; острый пар подают через все вводы в аппарат. Вентиль выхода воды из рубашки должен быть открыт. Сброс конденсата осуществляется через нижний спуск.

Стерилизацию ведут при температуре (131±1)^оС и давлении 0, 18-0, 2 МПа в течение 1 часа. По окончании стерилизации производят перевод с парового давления на воздушное Р – 0, 15 МПа путем подачи стерильного воздуха. Вручную, по расходомеру, устанавливают расход стерильного воздуха, после чего посевной аппарат готов к приему питательной среды.

2.2. Приготовление питательной среды в инокуляторе

Состав среды:

В отдельной емкости развести муку в холодной воды, добавить в горячую воду при интенсивном перемешивании. При интенсивном перемешивании нагреть до 90 ^оС, выдержать 1 час. Охладить до (31±1)^оС.

В инокулятор с заваренной мукой добавить простерилизованный кукурузный экстракт, пеногаситель, соли из дозатора сухих солей (поз. Д-11) и воду до 4, 4 л.

Затем приступают к стерилизации.

2.3. Стерилизация питательной среды

Стерилизацию питательной среды проводят непосредственно в посевном аппарате при температуре 121^оС и давлении Р – 0, 2 МПа в течение 1 ч, затем охлаждают до (31±1)^оС подачей холодной воды в рубашку аппарата. При этом в аппарате поддерживают давление 0, 03-0, 05 МПа подачей стерильного воздуха через барботер.

Доводят рН до 4, 0, проводят стерильный отбор проб для микробиологического и биохимического контроля. Среда должна быть стерильной.

2.4. Засев и выращивание культуры в инокуляторе.

Засев питательной среды проводят закрытым способом при соблюдении стерильности.

Перед засевом останавливают мешалку, снижают давление в аппарате до 0, 01 МПа.

Для засева используют колбы с посевным материалом (стадия ТП-I) в количестве 10 % объемных.

После засева устанавливают аэрацию из расчета 1 объем воздуха на 1 объем среды в мин, температуру (31±1)^оС, контроль и регулирование температуры осуществляется с помощью приборов КИПиА, расход воздуха, подаваемого в аппарат – 0, 26 м³/ч, рН в процессе ферментации поддерживается 4, 0, пенообразование незначительное, перемешивание 120 об/мин и давление в аппарате – 0, 02-0, 03 МПа.

Продолжительность культивирования 64-72 часа, накопление биомассы не менее 13 г/л, активность лакказы не менее 3, 5 ое/мл·мин.

В процессе роста через каждые 4 часа проводят стерильный отбор проб (в асептических условиях) для микробиологического и биохимического контроля.

Микробиологический контроль предусматривает наблюдение за развитием культуры, а также выявление посторонней микрофлоры методом микроскопирования и высевом отобранных проб на среде МПА.

Биохимический контроль предусматривает наблюдение за биохимическими процессами (рН, ферментативная активность, накопление биомассы, РВ).

На основании биохимического и микробиологического контроля сменный микробиолог дает указание по ведению процесса культивирования, поддержанию параметров на прежнем уровне.

Потери при культивировании в инокуляторе составляют 0, 15% (брызгоунос и испарение).

Культуральная жидкость должна отвечать следующим требованиям: оксидазная активность не менее 3, 5 ое/мл·мин, хорошее морфолого-физиологическое состояние культуры (см. ст. 1.1.), отсутствие посторонней микрофлоры.

Окончание ферментации определяют по максимальной активности лакказы (приблизительно через 15 часов после прекращения потребления щелочи).

Некондиционная культуральная жидкость направляется на стадию ОБО-2.