Принцип методу визначення холестеролу в сироватці крові

Методи визначення загального холестерину поділяються на:

1) колориметрические. Налічується близько 150 колориметрических методів, що грунтуються на реакціях утворення кольорових комплексів;

2) нефелометрические методи, засновані на порівнянні ступеня каламутності стандартного і досліджуваного розчину;

3) титрометричні методи;

4) флюоріметріческіе методи, що дозволяють визначати холестерин в мікрооб'ємах сироватки крові (наприклад, в 0, 01 мл її);

5) Газохроматографічні і хроматографічні методи;

6) гравіметричні методи.

Метод визначення загального холестерину в сироватці крові, заснований на реакції Лібермана-Бурхарда (метод Ілька)

Принцип методу

У сильнокислой безводному середовищі ХС взаємодіє з сумішшю сірчаної, оцтової кислот і оцтового ангідриду. У ході реакції ХС послідовно окислюється. При цьому кожна стадія реакції супроводжується утворенням молекули ХС, яка має на одну подвійну зв'язок більше, ніж з'єднання, з якого вона утворилася. В результаті кінцевого окислення іона 3, 5-холестодіена виходить забарвлене з'єднання, розчинена в сірчаної кислоти і дає максимум абсорбції при 410 і 610 нм. Через нестійкості забарвлення сполуки час фотометрірованія має бути точно витримано.

Реакційна суміш зі стандартним розчином ХС має смарагдовий колір. Однак проби сироватки можуть давати зелений, блакитний, бурий кольору. Це пов'язано з тим, що в результаті утворення ендогенного тепла в реакцію вступають багато компонентів сироватки крові. Крім того, в реакції Лібермана-Бурхарда вільний ХС і його ефіри утворюють кольорові комплекси з різним коефіцієнтом молекулярного поглинання. У разі високого вмісту ефірів ХС оптична щільність виявляється більш високою. Оскільки на пряме визначення ХС впливають багато факторів, реакцію ХС з сумішшю Лібермана-Бурхарда не можна вважати специфічною.

Прямий метод визначення ХС відносно простий у виконанні і недорогий. Однак токсичність і здатність викликати корозію системи в сучасних аналізаторах обмежують застосування методу. У великих лабораторіях перевагу віддають ферментативним методів визначення ХС.

Референтні величини: холестерин 4, 65-6, 46 ммоль/л (180-250 мг/дл).

При концентрації холестерину в пробі вище 16 ммоль/л сироватку розводять фізіологічним розчином у співвідношенні 1: 1 (результат).

Реакція чутлива на зміну температури, тому необхідно особливо дотримуватися охолодження реакційної суміші після добавки сірчаної кислоти.

Білірубін в концентрації вище 50 мкмоль/л впливає на результат аналізу. Інтерференцію білірубіну можна виправити розрахунком. Зміст 17 мкмоль/л білірубіну призводить до завищення вмісту холестерину в сироватці приблизно на 0, 1 моль/л.

Сироватка повинна бути негемолізірованной.

Необхідні реактиви

1. Крижана оцтова кислота.

2. Концентрована сірчана кислота.

3. Оцтовий ангідрид.

4. Абсолютний етиловий спирт.

5. Кислотна суміш: в суху колбу наливають 10 мл крижаної оцтової кислоти і 50 мл оцтового ангідриду, потім при постійному перемішуванні і охолодженні додають 10 мл концентрованої сірчаної кислоти. Суміш повинна бути безбарвною або злегка жовтуватою. Зберігати в холодильнику в темній склянці з притертою пробкою.

6. Калібрувальний розчин: 232 мг холестерину розчиняють в 2-3 мл хлороформу і доводять до об'єму 100 мл абсолютним етиловим спиртом. Приготований розчин містить холестерин в концентрації 6 ммоль/л.

Хід визначення

До 2, 1 мл кислотної суміші повільно по стінці пробірки додають 0, 1 мл плазми або сироватки без ознак гемолізу, перемішують струшуванням і ставлять на 20 хв у термостат або водяну баню при температурі 37 ° С, потім фотометрують в кюветі з довжиною оптичного шляху 0, 5 см проти реактиву при довжині хвилі 625 нм.

Побудова калібрувальної кривої і розрахунок. До 0, 05-0, 2 мл калібрувального розчину додають таку кількість кислотної суміші, щоб загальний обсяг був 2, 2 мл, перемішують і витримують 20 хв при температурі 37 ° С, так само як і досвідчені проби, а потім фотометрують. Забарвлення калібрувальної проби, в яку взято 0, 05 мл калібрувального розчину, відповідає змісту холестерину в плазмі 3 ммоль/л, проби, в яку взято 0, 1 мл, - змістом 6 ммоль/л тощо

Примітки

1. Попадання води призводить до помутніння розчину.

2. Сліди гемолізу або жовтушність досліджуваної плазми або сироватки служать причиною завищених результатів.

3. Можна використовувати для фотометрії та кювети з довжиною оптичного шляху 1 см, тоді кількість кислотної суміші подвоюють, а кількість досліджуваного матеріалу залишається колишнім.

Метод визначення вмісту холестерину в сироватці крові, заснований на холестеролоксідазной реакції

Принцип методу

Холестерин і його ефіри виділяються з ліпопротеїнів детергентами. Холестерінестераза гидролизует ефіри. У результаті подальшого ферментативного окислення холестерину холестеріноксідазой утворюється Н2О2.

Ефір холестерину + Н2О2? холестерин + жирні кислоти;

Холестерин + О2? холеста-3-ОН + Н2О2;

Н2О2 + n-хлорфенол + 4-аміноантипірину? хіноніміновий барвник + Н2О2.

Рівні норми ХС, виявлені при обстеженні " загалом здорового населення", відносно високі. З точки зору ризику розвитку ішемічної хвороби серця рівні ХС бажані:

1) рекомендований - менш 5, 18 ммоль/л;

2) помірний ризик - 5, 18-6, 19 ммоль/л;

3) високий ризик - більш 6, 22 ммоль/л.

Клініко-діагностичне значення

Збільшення концентрації ХС спостерігається при полігенною гиперлипопротеидемии типу II А і II Б, III, гиперлипопротеидемии I, IV, V типів, вторинної, придбаної гиперлипопротеидемии, відзначається також при захворюваннях печінки, внутрішньо-і внепеченочном холестазе, гломерулонефриті, нефротичному синдромі, ХНН, злоякісних пухлинах підшлункової залози, простати, гіпотиреозі, подагрі, ІХС, вагітності, діабеті, алкоголізмі, анальбумінеміі, дісглобулінеміі, гострої переміжної порфірії.

Зниження концентрації холестерину виявлено при дефіциті? -ліпопротеїду (хвороба Танжера), гіпо-та а-? -ліпопротеїдемія, некрозі печінкових клітин, злоякісних пухлинах печінки, гіпертиреозі, порушенні всмоктування, порушенні харчування, мегалобластноїанемії, сидеробластної анемії, таласемії, гострих тяжких захворюваннях, великих опіках, хронічних обструктивних захворюваннях легенів, розумової відсталості, ревматоїдному артриті, лімфангіоектазіі кишечника.

Відмічені сезонні коливання рівня ХС, більш високі восени і взимку, більш низькі навесні і влітку. Повторне визначення ХС після інфаркту міокарда необхідно проводити через три місяці.

Метод визначення вмісту ліпопротеїнів високої щільності в сироватці крові

Ліпопротєїни дуже низької щільності (ЛПДНЩ) і низької щільності (ЛПНЩ) в протилежність ліпопротеїнів високої щільності (ЛПВЩ) утворюють нерозчинні комплекси з гепарином в присутності іонів марганцю. У надосадової рідини, що залишилася після осадження ЛПНЩ і ЛПДНЩ, залишається? -Холестерин або ЛПВЩ.

Нормальний вміст ХС ЛПВЩ в сироватці крові становить 0, 9-1, 9 ммоль/л.

Рекомендуються наступні показники оцінки ймовірності розвитку атеросклерозу (табл. 8).

Принцип методу

Хіломікрони, ЛПДНЩ (ліпопротеїни дуже низької щільності) і ЛПНЩ (ліпопротеїни низької щільності) осідають додаванням фосфорно-вольфрамової кислоти і хлориду магнію.

Після центрифугування супернатант містить ЛПВЩ (ліпопротеїни високої щільності) - фракцію, вміст холестерину в якій визначається ферментативно.

Отримані значення достовірні, якщо:

1) в пробі немає хиломикронов;

2) концентрація триацилгліцеридів не перевищує 400 мг/100 мл;

3) в пробах не виявляється слідів III типу дисліпопротеїнемії.

При вимірі на Hg 546 нм відбувається завищення кількості ЛПВЩ холестерину спектром поглинання гемоглобіну, яке можна ігнорувати при значеннях до 200 мг Нb/100 мл.

Отриманий при центрифугировании супернатант повинен бути прозорий. Якщо проба містить велику кількість тригліцеридів (більше 1000 мг/100 мл), осадження ліпопротеїнів може бути неповним (каламутний супернатант) або частину осаду може плавати на поверхні. У цих випадках розвести зразок 1: 1 0, 9%-ним розчином NaCl і повторити осадження.

Клініко-діагностичне значення ХС-ЛПВЩ

Епідеміологічні дослідження показали зворотну залежність між рівнями ХС-ЛПВЩ і поширеністю ІХС. Визначення ХС-ЛПВЩ сприяє виявленню ризику розвитку ІХС.

Підвищенню рівня ХС-ЛПВЩ сприяють такі захворювання, як первинний біліарний цироз, хронічний гепатит, алкоголізм, інші хронічні інтоксикації.