Методы микробиологических исследований( микроскопия, выделение чистых культур микроорганизмов, культивирование, идентификация) Правила работы в микробиологической лаборатории.

Микроскопия— изучение объектов с использованием микроскопа. Подразделяется на несколько видов: оптическая микроскопия, электронная микроскопия, многофотонная микроскопия, рентгеновская микроскопия, рентгеновская лазерная микроскопия и предназначается для наблюдения и регистрации увеличенных изображений образца.

Методы выделения чистых культур м/организмов основаны на изоляции одной микробной клетки от массы м/организмов и последующем выращивании потомства этой клетки на питательных средах изолированно от других видов.

Наиболее распространенным способом выделения чистых культур является посев смеси микробов на плотные питательные смеси с целью получения отдельных колоний культур, которые считают результатом развития одной клетки. Для посева чаще используют агаризованные среды в чашках Петри. Основной задачей метода является разведении концентрации м/организмов в исследуемом материале с таким расчетом, чтобы при посеве его на питательную среду выросли изолированные колонии.

Культивирование (ферментация) - это процесс, во время которого микроорганизмы растут (увеличивают свою численность) и превращают компоненты питательной среды в целевой продукт. В качестве микроорганизмов могут использоваться дрожжи, грибы или бактерии. В том случае, когда в качестве организмов-продуцентов используются клетки животных или гибридомы, говорят о культуре клеток. Одно из требований к процессу культивирования состоит в обеспечении микроорганизмов или культуры клеток условиями, благоприятными для их оптимального роста и образования продукта. Это требование реализуется с помощью биореактора (ферментера).

Особенностью бактериологических работ является постоянное соприкосновение сотрудников лаборатории с заразным материалом, культурами патогенных микробов, заражёнными животными, кровью и выделениями больного. Поэтому все сотрудники бактериологической лаборатории обязаны соблюдать следующие правила работы, которые обеспечивают стерильность в работе и предупреждают возможность возникновения внутрилабораторных заражений:

· В помещения бактериологической лаборатории нельзя входить без специальной одежды — халата и белой шапочки или косынки.

· Нельзя вносить в лабораторию посторонние вещи.

· Запрещается выходить за пределы лаборатории в халатах или надевать верхнее платье на халат.

· В помещении бактериологической лаборатории категорически запрещается курить, принимать пищу, хранить продукты питания.

· Весь материал, поступающий в лабораторию, должен рассматриваться как инфицированный.

· При распаковке присланного заразного материала необходимо соблюдать осторожность: банки, содержащие материал для исследования, при получении обтирают снаружи дезинфицирующим раствором и ставят не прямо на стол, а на подносы или в кюветы.

· Переливание жидкостей, содержащих патогенные микробы, производят над сосудом, наполненным дезинфицирующим раствором.

· О случаях аварии с посудой, содержащей заразный материал, или проливания жидкого заразного материала надо немедленно сообщать заведующему лабораторией или его заместителю. Мероприятия по обеззараживанию загрязнённых патогенным материалом платья частей тела, предметов рабочего места и поверхностей осуществляют немедленно.

· При исследовании заразного материала и работе с патогенными культурами микробов необходимо строго соблюдать общепринятые в бактериологической практике технические приёмы, исключающие возможность соприкосновения рук с заразным материалом.

· Заражённый материал и ненужные культуры подлежат обязательному уничтожению, по возможности в тот же день. Инструменты, использованные в работе с заразным материалом, тотчас посте их употребления дезинфицируют, как и поверхность рабочего места.

· При выполнении бактериологических работ нужно строго следить за чистотой рук: по окончании работы с заразным материалом их дезинфицируют. Рабочее место в конце дня приводят в порядок и тщательно дезинфицируют, а заразный материал и культуры микробов, необходимые для дальнейшей работы, ставят на хранение в запирающийся рефрижератор или сейф.

· Работники бактериологической лаборатории подлежат обязательной вакцинации против тех инфекционных болезней, возбудители которых могут встретиться в исследуемых объектах.

Морфология и структурно-функциональная организация прокариот. Уровни клеточной организации прокариот, их отличия от эукариот. Особенности клеток цианобактерий, актиномицет, архебактерий.

Размеры бактерий колеблются в широких пределах: от 1 до 10-15 мкм. В основе морфологии клеток прокариот лежат две основные формы: шар и цилиндр. Различают кокки – шарообразные клетки и их группировки (диплококки, тетракокки, стрептококки – цепочки кокков, стафилококки – скопления кокков в виде виноградной грозди и т.д.), прямые палочки – бациллы, короткие, изогнутые – вибрионы, извитые бактерии – спириллы и спирохеты. Известны клетки, изогнутые полумесяцем, и длинные гибкие клетки с заострёнными концами. Наконец, имеются бактерии, обладающие выростами, - это так называемые простекобактерии. Обнаружены бактерии, имеющие форму шестилучевой звезды, куба, плоского диска, треугольника.

Основная особенность строения бактерий – отсутствие ядра. Наследственная информация у них заключена в одной молекуле ДНК, имеющей форму кольца и погружённой в цитоплазму. Поверхность клетки может быть покрыта полисахаридной или белковой капсулой. Для передвижения в жидкой среде некоторые клетки прокариот, как и у эукариот, обладают одним – двумя или многочисленными жгутиками. Иногда клетка может быть покрыта многочисленными ворсинками. Бактериальная клетка окружена цитоплазматической мембраной, отделяющей цитоплазму от клеточной стенки. У некоторых бактерий она может образовывать впячивания внутрь клетки – инвагинации. На мембране локализованы ферменты, осуществляющие синтез молекул, обладающих высокоэнергетическими связями (АТФ), энергия которых нужна для катализа биохимических реакций клетки. В цитоплазме мембранных структур содержится мало. В ней находятся рибосомы, осуществляющие синтез белков. Довольно часто в клетках разных бактерий содержатся запасные вещества: полисахариды, гликоген, сера, полифосфаты и др. Эти соединения могут продлевать жизнь клетки при отсутствии внешних источников энергии.

Основные различия прокариот и эукариот:

· У эукариот генетический материал локализован в структурно оформленном ядре. У прокариот наследственный материал представлен клубком двойной спиральной нити ДНК и не отделён от цитоплазмы какой – либо мембраной.

· У прокариот, в отличие от эукариот, отсутствуют внутриклеточные органеллы, имеющие хотя бы элементарную мембрану.

· У прокариот рибосомы имеют меньший размер.

· Клеточная стенка прокариот содержит специальный полимер пептидогликан, которого нет у эукариот.

· Жгутики прокариот состоят из одной или нескольких фибрилл, а у эукариот каждый жгутик состоит из микротрубочек – 9 по периметру и 2 в центре.

· Многие прокариоты способны фиксировать молекулярный азот, эукариоты этим свойством не обладают.

Клетки цианобактерии могут быть округлой, эллиптической, цилиндрической и другой формы. Некоторые цианобактерии являются одноклеточными, другие соединены в цепочки и очень немногие образуют округлые или неправильной формы колонии, в которых множество клеток покрыто общим слизистым чехлом (рис. 6). Некоторые цианобактерии могут образовывать нити длиной до 1 м и более и способны наращивать большую биомассу. Любая клетка может разделиться. Вновь созданные клетки способны дать начало новым колониям или нитям. Подобно другим нитчатым и колониальным формам бактерий, цианобактерии прикреплены друг к другу только оболочками, или слизистыми капсулами, поэтому каждая клетка не зависит от других.

В клетках цианобактерий, как и других бактерий, отсутствует ядро, пластиды, митохондрии и другие органеллы. Внутри клетки, во впячиваниях цитоплазматической мембраны, содержатся различные пигменты (красящие вещества): хлорофилл, каротин (оранжевый), фикоэритрин (красный), фикоцианин (синий), которые участвуют в поглощении света и обеспечивают фотосинтез. Эти пигменты и придают цианобактериям различную окраску: светло-золотистую, желтую, коричневую, красную, изумрудную, голубую, фиолетовую, темно-синюю. Благодаря своей окраске цианобактерии придают определенный цвет среде, где они обитают, особенно при массовом размножении

Косвенные данные позволят предположить у актиномицетов апикальный рост.

Дифференциация мицелия — процесс усложнения в процессе развития колонии актиномицета. Прежде всего она проявляется в делении на первичный (субстратный) и вторичный (воздушный) мицелий. Воздушный толще, он гидрофобен, содержит больше ДНК и ферментов, на поверхности его клеток имеются различные структуры (палочковидные, фиблиллы).Мицелий с редкими перегородками, практически ценоцитный у спорообразующих, с частыми перегородками (септами) у форм, для которых мицелий распадается и близких к ним. Вегетативные клетки большинства форм делятся поперечными перегородками, Geodermatophilus и Dermatophilus — во взаимно перпендикулярных направлениях, некоторые актиномицеты содержат клетки с септами, проходящими в совершенно разных направлениях (спорангии Micromonospora, везикулы Frankia). Ветвление происходит по механизму почкования.Часто дифференциация проявляется в образовании амицелиарных структур:

· коремии — тесное переплетение слившихся гиф, склеенных слизью с оксидами железа;

· агрегаты клеток;

· кристаллы вторичных метаболитов;

· «серные гранулы»;

· склероции — утолщённые гифы с вакуолями, заполненными липидами, может прорастать как спора;

· везикулы — инкапсулированные азотфиксирующие образования у Frankia.

В процессе старения цитоплазма клеток приобретает неравномерную электронную плотность, в ней перестают различаться рибосомы, граница нуклеоида расплывается, клеточная стенка становится тонкой и рыхлой, образуется микрокапсула. При автолизисе в цитоплазме образуются обширные светлые участки, нуклеоид распадается, в клеточной стенке образуются отверстия, клетка заполняется мембранными структурами, разрушающимися последними.