Вакцинный штамм БЦЖ

Другим классическим примером видоизменчивости возбудителя туберкулеза является вакцина БЦЖ- это вакцинный штамм микобактерий, широко используемый для специфической профилактики туберкулеза. Он был получен французскими учеными Calmett и Guerin назван их именами (БЦЖ - Bacilles (рис. 3). Это от­крытие явилось поворотным пунктом в развитии специфической профилактики туберкулеза.

Авторы в течение 13 лет путем многократных, последовательных пассажей (230 пассажей) вирулентного штамма микобактерий туберкулеза бычьего вида на среде с глицериновым картофелем и бычьей желчью добились значительного и стойкого изменения свойств микроорганизма. Многочисленными опытами на животных при введении препарата разными методами и дозами были показаны основные свойства микобактерий вакцинного штамма: специфичность, иммуно-генность, аллергенность и стойкая авирулентность. Убедившись в иммуногенности и безвредности штамма БЦЖ для животных в экспе­рименте, Calmett и Guerin в 1921 году впервые применили вакцину БЦЖ (трехкратно через день по 2 мг перорально) новорожденному ребенку, находящемуся в контакте с бациллярным больным. Ребенок хорошо перенес вакцинацию и оставался здоровым в течение 5, 5 лет наблюдения.

рис. 3. В 1919 французский микробиолог А. Кальметт и ветеринарный врач К. Герен создали вакцинный штамм микробактерий для противотуберкулезной вакцинации людей, который получил название «бациллы Кальметта-Герена (ВОС)». Впервые вакцина ВСО была введена новорожденному ребенку в 1921 г.

В клинике это сопровождается появлением положительной кожной чувствительности к туберкулину и развитием противотуберкулезного поствакцинального иммунитета. Такая иммунобиологическая перестройка организма сопровождается повышенной резистентностью к последующему заражению вирулентными микобактериями туберкулеза, которая проявляется меньшей пораженностью внутренних органов и более длительной выживаемостью вакцинированных БЦЖ животных по сравнению с контрольными. Было установлено, что штамм БЦЖ обладает некоторыми биохимическими свойствами, присущими вирулентным микобактериям.

Так, он является каталазоактивным, то есть способным разлагать перекись водорода - конечный токсический продукт жизнедеятельности микроба. В микрокультуре БЦЖ может расти в виде характерных «кос» и «жгутов», что обусловлено наличием по периферии клетки склеивающего вещества – корд-фактора. Calmett было установлено, что при выращивании на искусственных питательных средах штамм БЦЖ способен вырабатывать туберкулин. Однако туберкулин, полученный при выращивании БЦЖ, значительно менее активен тех туберкулинов, которые были получены из вирулентных мико-бактерий туберкулеза, но при внутрикожном введении больным туберкулезом морским свинкам он может вызывать положительную (ту­беркулиновую) реакцию.

В.И. Пузик (1966 г.), изучив морфологические изменения под влиянием вакцины БЦЖ у морских свинок, в первые же часы после вакцинации отметила появление в органах и системах выраженной пролиферации лимфоидных элементов, сменяющейся гиперплазией активной соединительной ткани. Через 2-3 месяца автор обнаружила появление ограниченных специфических изменений, главным образом, в лимфатических узлах, а через 6 месяцев она уже отмечала восстановленную структуру пораженных органов.

Работами И.Р. Дорожковой и 3, С, Земсковой (1974, 1984) установлено, что вакцина БЦЖ вегетирует в организме экспериментальных животных в течение 5-8 месяцев в зависимости от метода вакцинации и дозы, но уже через 2 недели после вакцинации авторами описана ее трансформация в Ь-формы, которые в дальнейшем поддерживают нестерильный противотуберкулезный иммунитет в течение 5-7-10-15 лет.

В последние годы ведутся научные поиски по созданию новых вакцин. Стратегия их создания предусматривает два направления: применение живых вакцин или использование отдельных компонентов микобактерий (субунитные вакцины). Среди живых вакцин наиболее перспективными считаются ослабленные мутанты микобактерий, а также рекомбинантные штаммы БЦЖ, продуцирующие цитолизин, цитокин или же содержащие увеличенное количество антигенов.

В состав субунитных вакцин планируется включение ведущих антигенных субстанций микобактерий -добавление адъювантов или же голой ДНК. Преимуществом таких вакцин является отсутствие побочных реакций, недостатком – ограниченная продукция клонов СР4-лим-фоцитов.

Каждая из испытуемых в настоящее время вакцин имеет свои достоинства и недостатки, но ясно одно, что будущая вакцина должна быть более эффективной и безопасной, чем применяемая в настоящее время вакцина БЦЖ.

Генетика возбудителя туберкулеза

Расшифровка генома возбудителя туберкулеза была осуществлена с помощью его фаготипирования. В настоящее время известно более 250 фагов микобактерии; его геном содержит более 4.000.000 нуклеотидов и 4, 000 генов. Изучение последовательности молекул ДНК в хромосомах и плазмидах микобактерии является основой для разработки новых подходов к лечению лекарственно-устойчивого туберкулеза и разработки рекомбинатных противотуберкулезных вакцин.

Контрольные вопросы:

1. Перечислите примеры видоизменчивости МВТ.

2. Какие факторы влияют на видоизменчивость МВТ?

3.Укажите признаки, характерные для 1-форм МВТ.

4.Дайте определение вакцины БЦЖ.

VI. ЛЕКАРСТВЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ МИКОБАКТЕРИИ

ТУБЕРКУЛЕЗА

Одним из наиболее значимых в бактериологии и клинике вариантов видоизменчивости возбудителя туберкулеза в современной фтизиатрии является феномен лекарственной устойчивости. Лекарственная устойчивость может развиться у всех микроорганизмов при длительном применении лекарственных препаратов. Это биологическое явление впервые описал Р.Е.Эрлих в 191 1 г.

Возникновение лекарственно-устойчивых штаммов к противотуберкулезным препаратам является закономерным явлением. Природа устроена так, что она стремится к сохранению равновесия, существующего на Земле миллионы лет. Возникновение лекарственно-устойчивых штаммов (мутантных форм возбудителя) -это ответная защитная реакция природы для сохранения равновесия.

Установлено, что у впервые выявленных и ранее не леченных противотуберкулезными препаратами больных в мокроте может быть выявлен возбудитель туберкулеза с первичной лекарственной устойчивостью.

При хронических формах туберкулеза у лиц, уже получавших противотуберкулезное лечение, лекарственная устойчивость носит вторичный характер. Частота ее при таких формах, как фиброзно-кавер-нозной туберкулез, находится в пределах 80-95, 5%.

При микробиологическом исследовании патологического материала, полученного из казеозно-некротических фокусов в легких и внутригрудных лимфатических узлов, незарубцевавшихся каверн, хро­нической эмпиемы нередко выявляется «скрытая» лекарственная устойчивость. В активно размножающейся бактериальной популяции, как правило, наряду с лекарственно чувствительными микобактерия-ми имеется небольшое количество лекарственно резистентных штаммов в соотношении: штамм, устойчивый к изониазиду или стрептомицину на миллион, крифампицину-на 100 млн., к этамбутолу- на 100 тыс. чувствительных микобактерии. В каверне диаметром 2 см находится до 100 млн.бактерий, следовательно, там могут иметься штаммы, устойчивые ко всем препаратам. По мере уменьшения бактериальной популяции под влиянием противотуберкулезной химиотерапии уменьшается число штаммов, чувствительных к препаратам, но остается прежним или, чаще всего, нарастает число лекарственно устой чивых популяций. Это естественным образом отражается на клинических проявлениях болезни; развивается так называемый «лекарственно-устойчивый туберкулез».

В медицинской микробиологии и клинике туберкулеза издавна существовала теория адаптации в развитии лекарственной устойчивости, которая подразумевает постепенное привыкание МВТ к проти­вотуберкулезным препаратам. Это чаще всего происходит в результате неполноценного лечения при назначении неадекватных режимов, неправильного сочетания противотуберкулезных химиопрепаратов, низких доз, многократном приеме суточной дозы, преждевременном прерывании курса лечения.

В настоящее время, благодаря развитию молекулярной биологии, стало известно, что в основе приобретения лекарственной устойчивости лежит изменение генома микобактериальной клетки без об­ратимости чувствительности.

Уже по своей природе микобактерии нечувствительны ко многим антибиотикам. Это свойство в первую очередь связано с тем, что высокогидрофобная клеточная поверхность является физическим барьером для гидрофильных препаратов. Устойчивость микобактерии к антибиотикам обеспечивается активностью ряда ферментов: гидролаз, модифицирующих ферментов – бета-лактамазы, аминоглюкозид-ацетилтрансферазы и ряда других систем, взаимодействующих с лекарственными препаратами. Однако главная причина развития лекарственной устойчивости возбудителя закодирована в структуре его генома. Как уже упоминалось, молекулярно-генетическими методами установлено, что возбудитель туберкулеза имеет достаточно крупный геном (4411529 пар нуклеотидов, содержит примерно 4.000 генов и имеет ряд повторяющихся последовательностей в нескольких копиях). Лабораторные исследования показали, что развитие феномена лекарственной устойчивости связано с нуклеотидными заменами (мутациями) в генах, кодирующих различные ферменты, которые взаимодействуют с лекарственными средствами. Известен ряд генов микробной клетки, ответственных за резистентность к рифампицину, изониазиду, этамбутолу, пиразинамиду и другим препаратам, мутации в которых вызывают изменение чувствительности к лекарственным препаратам.

Виды лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза к противотуберкулезным препаратам измеряются минимальной ингибирующей концентрацией (МИК) препарата, задерживающего рост МВТ в стандартных условиях постановки микробиологического опыта.

Чувствительными к данному противотуберкулезному препарату считаются штаммы МВТ, на которые этот препарат в критической концентрации (критерии резистентности) оказывает бактерицидное действие или бактериостатический эффект. Резистентность МВТ определяется снижением чувствительности до такой степени, что данный штамм способен размножаться при воздействии на него препарата в критической или более высокой концентрации. Имеются следующие виды лекарственной устойчивости (табл.2).

Таблица 2 'Виды лекарственной устойчивости

Наряду с этим определяется первичная (начальная) лекарственная устойчивость возбудителя туберкулеза, выделенного от больных, не принимавших противотуберкулезные препараты ранее или прини­мавших их не более 4 недель. В данном случае подразумевается, что больной с самого начала заражен лекарственно резистентным штаммом возбудителя туберкулеза. Вторичная (приобретенная) лекарственная устойчивость МВТ определяется как устойчивость, развившаяся в процессе химиотерапии. Приобретенную лекарственную устойчивость диагностируют у тех больных, которые имели в начале лечения чувствительные микобактерии туберкулеза, ставшие резистентными через 6 месяцев. Вторичная лекарственная устойчивость чаще всего бывает следствием неэффективно проводимой химиотерапии.

Рифампицин (К) является одним из наиболее эффективных ан-тимикобактериальных препаратов и обязательным компонентом используемых схем лечения. Вместе с тем, он относится к «универсальным» лечебным средствам по выработке лекарственной устойчивости. Устойчивость к нему чаще всего обусловлена точечными мутациями, нарушениями последовательности нуклеотидов в гене, обозначенном как РКОР (от английского определения -Rifampicin Resistence Determining Region. В настоящее время известно около 50 различных точечных мутаций, локализующихся в пределах RRGR-гена и приводящих к устойчивости к рифампицину. Сравнение генетической структуры нескольких штаммов показало, что устойчивость к рифампицину может быть маркером для определения резистентности к трем и более противотуберкулезным препаратам.

Изониазид- это синтетический бактерицидный препарат, наряду с рифампицином широко применяемый для лечения туберкулеза. Известно, что устойчивость возбудителя туберкулеза к изониазду обусловлена мутациями одновременно в четырех генах, которые участвуют в синтезе миколовых кислот:

- мутации в 40-60% случаев обнаружены на всем протяжении гена, кодирующего каталазу-пероксидазу (Ка4 9). Причина раз вития устойчивости заключается в уменьшении перехода изониазида в активную форму:

- мутации в 12-30% случаев встречаются в структурной и промоторной областях гена, кодирующего редуктазу еноил-ацитил- переносящего белка. При этом нарушается синтез липидов клеточной стенки;

- в 10-13% случаев мутации встречаются в межгенной регуляторной области гена алкилгидропероксид-редуктазы. Причина мутации заключается в нарушении детоксикации неорганических и органических пероксидов;

- в 10-12% случаев мутации встречаются егене, кодирующем редуктазу 6 кето-ацитиллереносящего белка. Причина мутации заключается в нарушении синтеза миколовых кислот.

Потеря чувствительности МВТ к стрептомицину связана с мутацией в генах, следствием которой является изменение в структуре рибосом и нарушение проницаемости внешних структур микроба для этого препарата.

Штаммы, устойчивые к фторхинолонам, имеют аминокислотные замены в альфа-субъединице ДНК-гиразы. Следствием мутации является снижение чувствительности фермента к препаратам данной группы.

Известны также гены, ответственные за резистентность к этам-бутолу; в 50% случаев наблюдаются мутации в гене, ответственном за проницаемость клеточной стенки.

При развитии устойчивости к пиразинамиду нарушается усвояемость препарата.

Контрольные вопросы:

1. Перечислите причины, вызывающие ЛУ МВТ.

2. Чем обусловлено развитие феномена «лекарственной устойчивости»?

3. Укажите виды лекарственной устойчивости МВТ.

4. Что включает в себя понятие «лекарственно-устойчивый туберкулез»?

Устойчивость микобактерий туберкулеза к внешним воздействиям

Микобактерий туберкулеза обладают значительной устойчивостью к различным факторам внешнего воздействия (химическим, физическим, температурным, световым, влажности). В естественных условиях при отсутствии солнечного света они могут сохраняться в течение нескольких месяцев. В уличной пыли возбудитель туберкулеза сохраняет свою жизнеспособность в течение 10 дней; на страницах книг - до 3 месяцев. При рассеянном свете они погибают через 1-1, 5 месяца. В воде сохраняются до 4 месяцев, в погребенных трупах могут сохраняться до нескольких месяцев. В лабораторных условиях в замороженном состоянии под вакуумом, а также в высушенном состоянии микобактерий могут оставаться жизнеспособными до 40 лет.

Исследование устойчивости МВТ, находящихся в культурах в различном патологическом материале, полученном от больных, является важной задачей дезинфекции жилищ, предметов пользования и пр.

Установлено, что культура МВТ, облученная солнечным светом, погибает в течение 1, 5 часов, ультрафиолетовые лучи убивают ее через 2-3 минуты. Во влажной мокроте при кипячении они погибают че­рез 5 минут, в высушенной мокроте - через 45 минут; 3-5% раствор хлорамина убивает их через 5 часов; 1-2% раствор хлорамина, активированный сульфатом аммония, - через 3 часа, 10-20% хлорная известь -через 2, 5 часа.

Дезинфекция представляет собой процесс уничтожения большинства болезнетворных микроорганизмов.

В настоящее время для дезинфекции при туберкулезе используют несколько групп дезинфицирующих препаратов (табл. 3).

Таблица 3 Группы дезинфицирующих препаратов

Ультрафиолетовый свет также используется для дезинфекции поверхностей предметов или воздуха в помещении. Большая часть эффективных ультрафиолетовых лучей не проникает через обычное стекло, которое мешает облучению. Эффект ультрафиолетового облучения зависит как от времени экспозиции, так и от расстояния до лампы. Чем дольше экспозиция и ближе расположена лампа, тем более выражен эффект.

Солнце излучает ультрафиолетовый свет. Солнечные лучи также могут использоваться для дезинфекции воздуха в помещении, мягких вещей, постельных принадлежностей больных.

Контрольные вопросы:

1. Как влияют факторы внешней среды на жизнедеятельность МВТ?

2. Перечислите группы дезинцифирующих препаратов.

т.. тжо& АыгЕрум бычьего и африканского

видов

Микобактерии бычьего вида (тусоЬас1епит

Человеческий организм чувствителен не только к микобактериям туберкулеза человеческого вида (rycobacterium tuberculosis), но и к микобактериям бычьего вида (rycobacterium bovis). Морфологически микобактерии бычьего вида представляют собой короткие палочки длиной не более 1 мк.м, с широким диаметром, часто изогнутые. На питательных средах из глицеринового бульона они растут медленнее, чем микобактерии человеческого вида. В противоположность последним не увеличивают кислотность среды, поскольку используют глицерин без расщепления его на кислоты. Отмечено, что прибавление глицерина к яичным средам замедляет рост rycobacterium bovis и ускоряет рост тусоЬас. В связи с этим лучшей средой для выделения и дифференциации тусоЬас1епит ьоу/з является яичная не глицериновая среда (Дорсе), тогда как для rycobacterium tuberculosis наилучшей является среда с добавлением 5% глицерина.

Согласно Йенсену штаммы rycobacterium bovis на яичной среде дают рост на 30-45-60 дни в виде колоний белого или сероватого цвета. Это маленькие круглые, влажные, почти прозрачные колонии, в то время как rycobacterium tuberculosis дают первичный рост на 21 -45-60 дни в виде сухих, неправильной формы колоний с шероховатой поверхностью. Они имеют кремовый оттенок. Но использование только культуральных методов исследования не позволяет с полной достоверностью идентифицировать вид микобактерии туберкулеза.

Известен цитохимический метод идентификации этих видов, rycobacterium bovis в отличие от rycobacterium tuberculosis почти не синтезируют никотиновую кислоту (ниацин). В связи с этим ниациновый тест для rycobacterium bovis оказывается отрицательным (ниационовая проба Конно). Наиболее надежным способом определения вида микобактерии туберкулеза является заражение культурой кролика (биологическая проба). Микобактерии бычьего вида при внутривенном введении культуры даже в минимальной дозе (0, 01 мг) вызывают у животного генерализованный туберкулез, а доза 1 мг часто приводит к прогрессирующему течению процесса с быстрым смертельным исходом. Если кролик погибает на 30-60 дни после заражения при наличии генерализованного или очагового туберкулеза, речь идет, скорее всего, об инфицировании микобактериями бычьего вида. В то же время кролики, зараженны.е даже 1 мг внутривенно введенных rycobacterium tuberculosis редко погибают в этот промежуток времени. После эфтаназии и вскрытия животных единичные очаги чаще обнаруживаются в легких, иногда в почках. Они не имеют признаков про-грессирования. Нередко поражение органов отсутствует полностью. Чувствительность разных животных к rycobacterium tuberculosis и rycobacterium bovis различна, rycobacterium bovis. rycobacterium bovis при любом методе введения у рогатого скота вызывает прогрессирующий туберкулез, который приводит животных к гибели, rycobacterium tuberculosis введенные даже внутривенно, вызывают только небольшие туберкулезные изменения в виде ограниченных бугорков, которые полностью регрессируют.

Морские свинки и крысы в меньшей степени чувствительны к rycobacterium bovis, чем к rycobacterium tuberculosis; собаки высоко резистентны как к rycobacterium tuberculosis, так и к rycobacterium bovis. У кошек, коз, ягнят rycobacterium bovis вызывают почти постоянно распространенные изменения, приводящие к гибели, в то же время следствием заражения я rycobacterium tuberculosis вляются только ограниченные местные изменения, или же они вовсе отсутствуют. Некоторые птицы (канарейки, попугаи) легко подвергаются заражению rycobacterium bovis. rycobacterium africanum выделен из патологического материала больных, проживающих в Западной Африке. Морфологически, цитохимически этот вид занимает промежуточное место между rycobacterium bovis и. rycobacterium tuberculosis Данный вид отличается устойчивостью к некоторым ПТП: пиразинамиду, тибону; имеет высокую вирулентность для человека

Контрольные вопросы:

1. Дайте морфологическую характеристику МВТ бычьего вида,

2.Перечислите животных, наиболее восприимчивых к МВТ бы чьего вида.

3.Дайте краткую характеристику M.africanus,