По методу Циля-Нельсена

- кислотоустойчивые микобактерий туберкулеза имеют длину 1, 0-10, 0 мкм, они просматриваются в

виде тонких, изящных палочек, но иногда можно обнаружить изогнутые или извитые особи.

Палочковидные формы могут располагаться в виде небольших скоплений, напоминающих «птичью лапку»,

отдельных клеток или в виде кос, жгутов. Напоминаем, что микобактерий туберкулеза синтезируют

корд-фактор, способствующий косообразованию колоний (рис. 4); " при окраске карболовым фуксином кислотоустойчивые микобактерий выявляются в виде тонких, слегка

изогнутых палочек малиново-красного цвета, содержащих различное количество гранул (зерен);

микроорганизмы располагаются по одиночке, парами или в виде групп, выделяющихся на голубом фоне; " внутри отдельных микробных клеток могут обнаруживаться участки более интенсивного окрашивания, в

результате чего они похожи на «бусы», а более слабо окрашенные участки могут быть видны в виде

«полос»; • другие микроорганизмы, не относящиеся к m.tuberculosis, могут иметь различные формы - от длинных

палочек до кокковых форм с различной интенсивностью окрашивания.

Рис. 4. Рост микроколоний М. 1иЬегси1оз! 5 в виде жгутов и кос. Окраска по методу Циля-Нельсена, У в. 900 Люминесцентная микроскопия. Метод обладает более высокой чувствительностью в обнаружении микобактерий. Сущность люминесцентной микроскопии заключается в том, что клетки, окрашенные специальными красителями (флюорохромами), дают излучение в видимом спектре под действием облучения их ультрафиолетом Если тетки содержат специальный краситель, то молекулы под действием ультрафиолета начинают испускать кванты света в длинноволновой области, иначе говоря, «светятся». В этом случае клетка становится источником света определенного спектра и оказывается хорошо видимой на общем темном контрастном фоне препарата.

Способность МВТ воспринимать люминесцентные красители обеспечивает большую контрастность микроскопической картины и позволяет обнаружить КУМ при концентрациях 500-1.000 микробных тел в 1 мл материала.

Люминесцентная микроскопия позволяет дополнительно выявить МВТ на 17% больше по сравнению со световой микроскопией. Она незначительно уступает по чувствительности методу посева.

Другим важным преимуществом этого метода является способность обнаруживать измененные МВТ, утратившие под влиянием ряда неблагоприятных факторов (интенсивной химиотерапии) свойство кис­лотоустойчивое™ и не выявляющиеся в связи с этим при окраске по методу Циля-Нельсена.

При люминесцентной микроскопии используют специальный микроскоп. Источником света служит кварцгалогеновая или ртутная лампа.

Метод окраски аурамином и родамином (модифицированная окраска по Бою):

• на стекла с фиксированными мазками наливают раствор 1 (аура-мин ОО 1, 0+родамин С 0, 12+дистиллированная вода 1.000 мл) на 1 час;

• тщательно/промывают дистиллированной водой;

• обесцвечивают соляно-кислым спиртом в течение 3-5 мин.;

• промывают дистиллированной водой;

• гашение фона осуществляют раствором 4 (хлорид метиленового синего 0, 3 г + дистиллированная вода 1.000 мл) в течение 60 секунд;

• мазки высушивают при комнатной температуре.

Бактерии, окрашенные ауромином и родамином, будут давать желтое, желто-оранжевое свечение.

Более чем столетний опыт фтизиатров всего мира показывает, что классическое сочетание культурального и микроскопических методов исследования по-прежнему остается высокоинформативным, несмотря на появление большого числа альтернативных методов.

Культуральный метод отличается большей чувствительностью, он позволяет выявить МВТ при наличии в исследуемом патологическом материале нескольких десятков жизнеспособных особей возбудителя (иногда всего лишь не более 10). Достоверно подтвердить туберкулезную природу заболевания, изучить биологические свойства выявленного возбудителя и выявить его лекарственную чувствительность возможно только при выделении семейства микобактерий культуральными методами исследования.

Для получения оптимальных результатов при изучении клинического материала необходимо соблюдать следующие условия:

• сбор клинического материала необходимо проводить до начала химиотерапии, так как даже несколько дней специфического лечения могут убить или уменьшить жизнеспособность значительного количества кислотоустойчивых бактерий и снизить результативность исследования;

• на фоне лечения противотуберкулезные препараты отменяются не менее чем за двое суток до сбора материала;

• материал для исследования должен собираться до утреннего приема лекарственных препаратов;

• при исследовании мокроты желательно собрать не менее трех проб утренней мокроты в течение 3 последующих один за другим дней;

• собранный материал необходимо как можно быстрее доставить в лабораторию; в случае невозможности доставки материал сохраняется в холодильнике при температуре +5-10°С;

• при перевозке материала необходимо тщательно следить за сохранностью флаконов.

Сущность метода заключается в получении культуральной массы МБТ путем засева обработанного детергентами диагностического материала на питательные среды, предназначенные для роста МБТ. Среди питательных сред выделяют три группы:

• плотные питательные среды на яичной основе;

«плотные или полужидкие питательные среды на агаровой основе;

• жидкие синтетические или полусинтетические питательные
среды.

Общепринятой стандартной средой для выращивания МБТ является плотная яичная питательная среда Левенштейна-Йенсена, которая состоит из яичной массы, приготовленной из свежих диетических яиц, вымытых проточной водой щеткой и мылом. Вымытые яйца погружают на 30 минут в 70% спирт. Кроме того, в среду входят следующие ингредиенты (солевой буфер): однозамещенный фосфорнокислый натрий, магний сернокислый, 1-аспарагин, глицерин, магний лимоннокислый. Для повышения эффективности роста возбудителя туберкулеза используется одновременно и вторая среда: Финна II. Эта среда отличается от предыдущей тем, что вместо 1-аспарагина в ней используется глутамат натрия и подбор солей рассчитан таким образом, что конечная кислотность среды (РН=6, 3-6, 5) имеет более низкое значение и большую стабильность. Эти свойства обусловливают более высокую эффективность среды при засеве материала, обработанного щелочными детергентами.

Для создания фона в среды вводится малахитовая зелень. Посевы помещают в термостат при температуре +37°С, так как оптимальный рост колоний т.1иЬегси1оз15 происходит при нормальной температуре организма человека. Посевы просматривают каждые 7-10 дней. Рост возбудителя появляется на 3-6 неделе, чаще в виде сухих шероховатых К-колоний. Положительный ответ лаборатория выдает только после микроскопии выросших колоний.

Культуральные исследования проводят как до начала лечения, так и в процессе него. В результате химиотерапии количество возбудителя может уменьшиться, появляются колонии с гладким влажным ростом, в диагностическом материале таких больных могут появиться 1-формы и кокковые формы МВТ.

При оценке результатов руководствуются следующими критериями:

• появление роста - срок появления, начиная со дня посева;

• интенсивность роста - число колоний;

• загрязнение посева посторонней микрофлорой или грибами;

• отсутствие роста.

На основании ^лучения сроков появления роста и его особенностей осуществляется первичная идентификация микобактерий;

• появление роста кислотоустойчивых микобактерий в течение 7-10 дней культивирования на плотных питательных средах свидетельствует о выделении быстрорастущих нетуберкулезных МВТ, к которым комплекс т.tuberculosis не относится;

• появление роста кислотоустойчивых микобактерий после 3-4 недель культивирования свидетельствует о выделении, т. tuberculosis а также других медленно растущих микобактерий, которые мо гут относиться к потенциально патогенным нетуберкулезным МВТ или к безвредным кислотоустойчивым сапрофитам;

• прежде чем дать отрицательный ответ после 2, 5-3 месяцев культивирования, необходимо убедиться в отсутствии роста очень медленно растущих МВТ, в числе которых могут быть и г.tuberculosis.

Характеристика колоний г.tuberculosis.. Обычно вирулентные культуры микобактерий туберкулеза растут на плотных питательных средах в виде К-колоний различной величины и вида, имеют желтоватый (но не желтый) или слегка кремовый оттенок (цвет слоновой кости), шероховатую поверхность, напоминающую крошки хлеба или цветную капусту. Колонии, как правило, сухие, морщинистые, но могут встречаться и влажные, слегка пигментированные колонии, розовато-желтый пигмент которых резко отличается от оранжевого или желтого пигмента сапрофитных или некоторых нетуберкулезных микобактерий. Последние обычно растут в виде 3-формы. Следует отметить, что на среде Финна колонии часто выглядят более влажными, чем на среде Левенштейна-Йенсена,

Ответ при культуральном исследовании на микобактерий туберкулеза дается только после микроскопии окрашенного по методу Циля-Нельсена мазка из выросших колоний.

Интенсивность роста обозначается по трехбалльной системе: (+) 1-20 колоний в пробирке - «скудное» бактериовыделение; (++) 21-100 колоний в пробирке - «умеренное» бактериовыделение; (+++) > 100 колоний в пробирке - «обильное» бактериовыделение.

Дифференциация r.tubercu/osis.. Одного какого-либо лабораторного метода, позволяющего отличить T.tuberculosis.oi других кислотоустойчивых микобактерий, не существует. Для дифференциации т.tuberculosis., /77. Bovis, /77. Africanum, m. microti от других кислотоустойчивых микобактерий используются следующие основные биохимические тесты:

•на наличие способности продуцировать никотиновую кислоту -•ниациновый тест;

•на наличие редуктазы;

• на наличие способности расти на среде с натрием салицилово-кислым (1 мг/мл);
Mycobacterium tubercu/osisS характеризует следующая совокупность признаков:

•медленная скорость роста; •температура роста - +35-37°С;

•отсутствие пигментообразования,

•положительный ниациновый тест;

•отсутствие термостабильной каталазы (68°С);

• отсутствие роста на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей паранитробензойную кислоту (500 мгк/мл), хлорид натрия (5%), изониазид (10 мкг/мл для лекарственно чувствительных r.tubercu/osis..

Радиометрический метод выявления микобактерий туберкулеза. В 1977 г. A.Middlebrook описал способ радиометрической детекции роста микобактерий в селективной жидкой среде, что положило начало выявлению возбудителя туберкулеза новым способом бактериологической диагностики.

С начала 80-х годов стала использоваться полуавтоматическая система ВАСТЕС-460 для выращивания и идентификации микобактерий с использованием жидкой среды A.Middlebrook 7 Н9.В данной системе рост возбудителя определяется путем регистрации уровня меченого С0₂, который образуется в процессе утилизации размножающимися микроорганизмами субстрата с пальмитиновой кислотой, содержащей радиоактивный углерод (С¹⁴). Применение этого.метода позволяет сократить сроки получения результатов выявления микобактерий до 5-6 дней. В настоящее время с целью регистрации роста возбудителя туберкулеза и определения его чувствительности к противотуберкулезным препаратам используется автоматизированная система ВАСТЕС №ЗЛГ 960. Данная система позволила проводить быструю идентификацию т.tuberculosis сотр/ех и определять лекарственную чувствительность возбудителя туберкулеза.

Для практических лабораторий оптимальные результаты культу-рального выявления микобактерий могут быть получены при использовании диагностический системы в комбинации с плотными средами (Левенштейна-Йенсена, Финн-Н).

Биологический метод диагностики микобактерий туберкулеза. Указанный метод применяется в лабораториях научно-исследовательских институтов, отличается высокой чувствительностью и превосходит культуральный. При наличии 1-10 живых микробных тел в 1 мл диагностического материала возможно развитие туберкулеза у животного. Наиболее чувствительными к r.tuberculosis являются морские свинки, к r.bovis кролики, белые мыши. Однако с введением в клиническую практику химиотерапии и появлением форм возбудителя, устойчивых к лекарственным препаратам, биологическая проба утратила свою эффективность, так как часто микроорганизмы, устойчивые к химиотерапевтическим препаратам, в частности к изониазиду, явля­ются авирулетными для морских свинок.

Для повышения частоты обнаружения в патологическом материале возбудителя туберкулеза помимо подкожного способа заражения можно использовать интратеетикулярный. При таком методе заражения удается чаще обнаруживать в патологическом материале изониа-зидоустойчивые слабовирулетные микобактерий.

Заражение морских свинок следует проводить в диагностических случаях для подтверждения туберкулезной этиологии заболевания как впервые выявленных, так и уже получавших противотуберкулезную терапию.

Особую ценность биологическая проба имеет у больных, страдающих урогенитальным туберкулезом.

Обработка материала для заражения морских свинок. Для заражения морских свинок используют различный материал: мокроту, мочу, промывные воды бронхов, желудка, экссудаты, отделяемое из ран, операционный материал.

Исследуемый материал обрабатывают, как и для посева, 3-4% серной кислотой (Н₂50₄).

После обработки кислотой его дважды отмывают стерильным физиологическим раствором, чтобы не осталось кислоты, так как при ее попадании животному под кожу может возникнуть язва.

К полученному осадку добавляют 1 мл стерильного физиологического раствора и вводят морской свинке под кожу правой паховой области или в область яичка.

За животным проводят наблюдение, проверяя появление местного инфильтрата, состояние регионарных лимфатических узлов и общее состояние.

Через 1, 5-3 месяца проверяют чувствительность к туберкулину, вводя внутривенно в среднюю часть брюшка 0, 1 мл туберкулина {100 ТЕ РРО-1). Реакцию учитывают через 48 и 72 часа. Положительной считают реакцию при появлении инфильтрата более 5 мм. Он бывает у свинок, инфицированных возбудителем туберкулеза.

При наличии в патологическом материале достаточного количества вирулентных микобактерий уже через 2 недели на месте заражения может появиться инфильтрат или язва. Регионарные лимфатические узлы увеличиваются через 1 месяц.

Забивают подопытных животных через 1, 5 или 3 месяца. Если заражены два животных одним и тем же патологическим материалом, то одно животное забивают через 1, 5, а другое - через 3 месяца. При забое морских свинок через 1, 5 месяца в месте введения патологического материала отмечают инфильтрат, нередко с распадом, увеличение регионарных лимфатических узлов, единичные туберкулезные очаги в легких, иногда - в селезенке.

При забое морских свинок через 3 месяца отмечается увеличение лимфатических узлов, как регионарных, так и отдаленных, появление очагов в легких, печени, селезенке.

Степень поражения внутренних органов зависит от количества и вирулентности МВТ, содержащихся в патологическом материале.

Иногда при обследовании олигобациллярных больных МВТ из патологического материала методом посева не выделяются, к при заражении подопытного животного могут определяться незначительные изменения в регионарных лимфатических узлах или в органах. В таких случаях рекомендовано делать посев из органов подопытного животного для получения культуры и ее дальнейшего изучения.

Молекулярно-генетические методы. К прямым методам обнаружения МВТ можно отнести молекулярно-генетические исследования, такие как способ полимеразной цепной реакции, в основе которого лежит многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК (направленная или избирательная амплификация ДНК). Главным достоинством этого метода является высокий уровень чувствительности (в диапазоне от 1 до 10 клеток в исследуеом материале), достигаемый за счет того, что в результате многократного копирования уровень специфическойм олигонуклеотидной последовательности возрастает в 10⁶-10 раз (положительные результаты анализа достигают 70-96%). Метод эффективен в отношении возбудителя туберкулеза, учитывая его высокую антигенную изменчивость (трансформация в 1-формы, персистирующие микроорганизмы и др.). С помощью этого метода можно выполнить идентификацию штамма возбудителя туберкулеза. Недостатком его является невозможность определения жизнеспособности выделенных микобактерии, а также риск возникновения ложноположительных и ложноотрицательных резуль­татов.

Косвенные методы определения наличия возбудителя туберкулеза в организме больного основаны на выявлении специфических антител к антигену в различных биологических субстратах. С этой целью используется метод иммуноферментного анализа (ИФА). Метод ИФА прост в исполнении, хорошо воспроизводим, требует небольшого количества патологического материала. С его помощью антигены и антитела можно выявлять в различном биологическом материале, полученном от больного,

Принцип метода состоит в том, что антитела в патологическом материале связываются со специфическим антигеном, адсорбированном на пластике. При этом образуется комплекс антиген-антитело.

Микробиологические методы определения лекарственной устойчивости. В настоящее время для определения лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам в нашей стране используются следующие основные методы:

• метод абсолютных концентраций;

• ускоренный метод Грисса;

• автоматизированная система ВАСТЕС-ТВ;

• молекулярно-генетический метод.

Метод абсолютных концентраций. Данный метод исследования выполняется на яичной среде Левенштейна-Йенсена, позволяет определять лекарственную устойчивость МБТ в диагностическом материале, содержащем любое количество колоний, поскольку для ее определения используются штаммы, предварительно выращенные на плотных питательных средах.

Поскольку сроки выделения возбудителя на питательных средах составляют не менее 1-1, 5 месяцев, результаты определения лекарственной устойчивости указанным методом поступают не ранее, чем через 2-2, 5 месяца после забора материала. Методы определения лекарственной устойчивости после выделения культуры МБТ получили название непрямых.

Критерии лекарственной устойчивости. Уровень устойчивости данного штамма выражается той максимальной концентрацией препарата (количество микрограмм в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается размножение микобактерии (по числу колоний на плотных средах).

Лекарственно устойчивые микроорганизмы способны размножаться при таком содержании препарата в среде, которое оказывает на чувствительные особи бактериостатическое или бактерицидное действие. Для различных препаратов установлена определенная концентрация (критическая), имеющая клиническое значение, при которой еще наблюдается размножение чувствительных к этому препарату микобактерии.

Границей или критерием устойчивости называют те наиболее низкие концентрации препарата в питательной среде, выраженные в микрограммах на 1 мл, при которых размножаются устойчивые особи. Определение лекарственной устойчивости МБТ необходимо проводить на плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена, При определении лекарственной устойчивости МБТ на плотных средах культура считается чувствительной к той концентрации препарата, которая содержится в среде, если число колоний, выросших на одной пробирке с препаратом, не превышает 20. При наличии более 20 колоний культура расценивается как устойчивая. Концентрации противотуберкулезных препаратов, используемых при определении лекарственной устойчивости МБТ, представлены в таблице 5.

Таблица 5