Работа 1. Распределительная хроматография аминокислот на бумаге

В настоящее время метод хроматографии является одним из наиболее простых, быстрых и точных методов анализа сложных смесей веществ. Он основан на различиях в скорости переноса растворенных веществ в системе двух фаз, одна из которых подвижна.

При хроматографии на бумаге неподвижной жидкой фазой является сорбированная на поверхности бумаги вода, а подвижной - смесь различных органических растворителей, насыщенных водой. Разделение веществ методом хроматографии на бумаге происходит в том случае, если эти вещества существенно различаются по своей растворимости в обеих жидких фазах. Метод распределительной хроматографии аминокислот на бумаге заключается в том, что каплю смеси аминокислот или гидролизата белка наносят на стартовую линию хроматографической бумаги, конец которой опускают в смесь органических растворителей. Чем меньше растворимость аминокислот в воде и чем больше их растворимость в органическом растворителе, тем быстрее они движутся за фронтом органического растворителя. Положение аминокислот на бумаге можно обнаружить при помощи цветной реакции с нингидрином.

Подвижность веществ при хроматографии на бумаге характеризуют с помощью коэффициента скорости движения (Rf), представляющего собой отношение расстояния (мм), пройденного веществом от линии старта, к расстоянию, пройденному фронтом растворителя.

Расстояние, пройденное аминокислотой, измеряют от места ее нанесения до середины пятна. Rf является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях.

Оборудование, реактивы: сушильный шкаф; электрическая плитка; капиллярные пипетки; кювета эмалированная; бутанол, уксусная кислота, вода в соотношении 40: 10: 50; 0, 5%-ный раствор нингидрина в ацетоне; 1%-ный раствор меди азотнокислой в ацетоне; смесь аминокислот.

Ход работы

Для проведения анализа берут полоску хроматографической бумаги шириной 1, 5 и длиной 12 - 14 см. Смесь аминокислот (фенилаланина и глицина) наносят в виде точки на стартовую линию, проведенную простым карандашом на расстоянии 1 см от короткого края бумаги. Растворы аминокислот наносят специальными капиллярными пипетками, не допуская расплывания нанесенного раствора до пятна диаметром более 0, 2 см.

В пробирку, служащую хроматографической камерой, наливают 1 мл верхнего слоя растворителя и закрывают пробирку пробкой. Полоску хроматографической бумаги с нанесенными аминокислотами осторожно помещают в пробирку с растворителем, следя за тем, чтобы растворитель был ниже линии старта. Укрепляют хроматограмму в пробирке, которую ставят в штатив под тягой. Процесс хроматографироавания длится 1 - 1, 2 часа. По окончании указанного срока отмечают на хроматограмме фронт растворителя и высушивают хроматограмму над плиткой. Затем хроматограмму проявляют 0, 5%-ным раствором нингидрина в ацетоне. После испарения ацетона при комнатной температуре хроматограммы прогревают в термостате при 60⁰С до появления пятен аминокислот. Для увеличения устойчивости окраски хроматограммы обрабатывают 1%-ным раствором азотнокислой меди в ацетоне. При этом лиловая окраска производных аминокислот переходит в оранжево-красную. Хроматограмму высушивают на воздухе при комнатной температуре, отмечают расположение аминокислот, вывчисляют их
Rf-индексы.

Сделайте рисунок хроматограммы и выводы по результатам опыта.

Работа 2. Определение
изоэлектрической точки белков

Вследствие наличия способных к ионизации групп (концевых групп СООН и NH₂, а также боковых групп дикарбоновых и диаминокислот) молекулы белков обладают электрическим зарядом: положительным и отрицательным. В кислой среде белки имеют суммарный положительный заряд:

R-NH₂ + H⁺ Û R-NH₃⁺,

в щелочной среде - отрицательный:

R-COOH + OH^- Û R-COO^- + H₂O.

При определенном значении pH среды величина положительных и отрицательных зарядов становится одинаковой и суммарный заряд белка оказывается равным нулю. Значение рН, при котором белок не имеет суммарного электрического заряда, называют изоэлектрической точкой (ИЭТ). В этом состоянии белки наименее устойчивы и легко выпадают в осадок, имеют наименьшее значение вязкости, растворимости, степени гидратации и электропроводности, не способны передвигаться к электрическим полюсам. Каждый белок имеет свое значение ИЭТ: казеин - 4, 6 - 4, 7; сывороточный глобулин - 5, 4; протамины – 10 – 12; и т.д. Существует целый ряд способов определения ИЭТ белков.

Оборудование, реактивы: пробирки, пипетки на 1, 5 и 10 мл, карандаш по стеклу; 0, 1 и 0, 01 н. растворы уксусной кислоты.

Материалы: 0, 5%-ный раствор желатина (растворяют 0, 5 г желатина при подогревании в 10 мл 1 н. раствора уксуснокислого натрия и добавляют воды до 100 мл).

Ход работы

В каждую из 8 пронумерованных пробирок по нижеприведенной таблице 1 вносят соответствующие растворы после перемешивания + 1 мл танина. В той пробирке, где обнаружится максимальное помутнение среды (визуально или нефелометрически), рН раствора будет соответствовать ИЭТ белка.

Таблица 1

По результатам опыта сделайте вывод об изоэлектрической точке белка.