Методы микробиологической диагностики бактериальных инфекций

В бактериологии для обнаружения возбу­дителя в исследуемом материале используют бактериоскопический, бактериологический, биологический методы.

Достоинствами бактериоскопического ме­тода являются его простота, быстрота, эконо­мичность. Однако он находит ограниченное применение, так как может быть использован лишь при наличии каких-либо морфологи-

ческих или тинкториальных особенностей возбудителя и при достаточном его содержа­нии в исследуемом материале. Как правило, этот метод является ориентировочным.

Основной, самый точный метод диагностики бактериальных инфекций — бактериологичес­кий, который используют почти при всех забо­леваниях, несмотря на такие его недостатки, как длительность исследования (от 4—5 дней до 2 месяцев), опасность (так как накапливается чистая культура возбудителя), сравнительная дороговизна. В том случае, если в исследуемом материале предполагается содержание возбу­дителя в достаточном количестве, посев ма­териала производят на плотные питательные среды для получения изолированных колоний. При незначительном содержании микробов ис­следуемый материал прежде засевают на жид­кие питательные среды — среды обогащения. Идентификацию выделенной чистой культу­ры производят по морфологическим, тинкто-риальным, культуральным, биохимическим, антигенным и токсигенным свойствам (в за­висимости от вида возбудителя). Определение перечисленных свойств позволяет установить вид возбудителя. С целью эпидемиологическо­го маркирования производят внутривидовую идентификацию выделенной культуры: опреде­ляют ее фаговар, биовар и др. Кроме того, для назначения рационального лечения, как прави­ло, определяют чувствительность выделенной культуры к антибиотикам.

При микробиологической диагностике за­болеваний, вызванных условно-патогенны­ми микробами, представителями нормальной микрофлоры, обязательным является опреде­ление количества возбудителей в исследуемом материале.

Биологический метод не экономичен, не гуманен и поэтому находит ограниченное применение. В качестве экспериментальных животных используют белых мышей, мор­ских свинок, кроликов, обезьян и других животных.

Постановка диагноза инфекционного забо­левания возможна также с помощью серологи­ческого метода, направленного на обнаруже­ние либо специфических антител в сыворот­ке больного, либо специфических антигенов непосредственно в исследуемом материале.

Антитела к возбудителю заболевания появ­ляются, как правило, к концу первой недели болезни. Невозможность обнаружить их в пер­вые дни заболевания является самым большим недостатком метода, особенно в тех случаях, когда заболевание протекает остро. Кроме то­го, при многих болезнях требуется изучение антителообразования в динамике и выявле­ние увеличения количества антител, что так­же не разрешает быстро поставить диагноз. Недостатком метода является и то, что он не позволяет точно идентифицировать возбуди­теля и определить его антибиотикограмму. Но в то же время это совершенно безопасный, относительно недорогой метод, позволяющий за несколько часов поставить диагноз. В насто­ящее время при ряде болезней определяют не только количество иммуноглобулинов, но и их принадлежность к различным классам.

При некоторых заболеваниях серологичес­кий метод применяют для выявления спе­цифических антигенов в исследуемом мате­риале. Поскольку специфические антигены, входящие в состав возбудителя, находятся в патологическом материале с первых минут болезни, этот вариант серологического ме­тода применяют для ускоренной (в течение первого дня болезни) или даже экспресс-диагностики (в течение нескольких часов) инфекционных заболеваний.

В качестве вспомогательного при неболь­шой группе инфекционных заболеваний ис­пользуют аллергологический метод, позво­ляющий выявить повышенную чувствитель­ность к специфическому антигену (аллергену), которым является возбудитель заболевания.

Особенности диагностики анаэробных ин­фекций. Для микробиологической диагности­ки анаэробной инфекции используют бакте-риоскопический и бактериологический методы. Серологический метод имеет ограниченное практическое применение из-за отсутствия коммерческих наборов диагностикумов. Для экспресс-диагностики применяется ГЖХ.

Бактериоскопический метод при диагностике анаэробной инфекции имеет незначительную информативность, поскольку анаэробы мор­фологически не отличаются от аэробных мик­роорганизмов, кроме тех редких случаев, когда анаэробы имеют характерную морфологию.

Бактериологическое исследование на анаэробы длительно, дорого и трудоемко. Окончательный ответ получают через 7—10 дней с момента забора исследуемого материа­ла. Посев производят на кровяные среды, обо­гащенные факторами роста (гемин, менадион, редуцирующие добавки). Посевы инкубируют в анаэробных условиях в анаэростатах или перчаточных боксах. Идентификацию выде­ленных чистых культур проводят на основании изучения культуральных, морфологических и тинкториальных свойств и ферментативной активности. Антигенные свойства анаэробов изучают редко из-за отсутствия коммерческих наборов диагностических сывороток.

Поскольку анаэробы высокочувствительны к токсическому действию кислорода воздуха, для работы с ними необходимо использовать анаэробную микробиологическую технику иссле­дования. Под анаэробной микробиологической техникой понимают комплекс приемов и мето­дов, позволяющих в бескислородных условиях обеспечить доставку материала в микробиоло­гическую лабораторию, выделение и иденти­фикацию анаэробов. С этой целью используют специальное лабораторное оборудование: анаэ­робные рабочие станции (перчаточные боксы), анаэростаты, инертный газ или газогенератор­ные системы, вакуумный насос, индикаторы анаэробиоза, транспортные среды, элективные питательные среды для анаэробов и тест-систе­мы для их идентификации.

Для транспортировки образцов, предназначенных для исследования на анаэробы, используют флаконы с транспортными средами, создающие анаэробные условия при транспортировке.

Для создания анаэробиоза в анаэростате откачи­вают воздух и после трехкратной вакуум-замести­тельной промывки анаэростаты заполняют бескисло­родной трехкомпонентной газовой смесью газом из баллона. Можно использовать и химическое связы­вание свободного кислорода. Для этого используют газогенераторную систему, содержащую борогидрит и бикарбонат натрия, в которой при добавлении во­ды происходит химическая реакция, протекающая со связыванием свободного кислорода и выделением углекислого газа и водорода.

Для контроля анаэробиоза в процессе инкубации по­севов используют индикаторы анаэробиоза — резазурин или метиленовую синь. В анаэробных бескислородных

условиях индикатор анаэробиоза находится в восстанов­ленной бесцветной форме, а при наличии кислорода — в окисленной окрашенной. Резазурин окрашивается в ро­зовый цвет, а метиленовая синь — в голубой.

При наличии в лаборатории большого объема ана­лизов целесообразно применение анаэробных рабо­чих станций, которые представляют собой защитный бокс 3-го класса (изолирующий) и являются газонеп­роницаемыми конструкциями, заполненными бес­кислородной газовой смесью.

Через 24—48 ч инкубирования посевов в аэ­робных и анаэробных условиях проводят диф­ференциацию выросших чистых культур на аэ­робы и анаэробы. Культуры, выросшие только в аэробных условиях, но не давшие роста в ана­эробных условиях, рассматривают как аэробы; культуры, выросшие одновременно в аэроб­ных и анаэробных условиях, рассматривают как факультативные анаэробы и в дальнейшем их идентифицируют по общепринятым схе­мам. Культуры, не выросшие в аэробных усло­виях, но давшие рост в анаэробных условиях, рассматривают как облигатные анаэробы и приступают к их идентификации.

Идентификацию анаэробов проводят в два этапа. На первом этапе идентификации ориентировочно определяют родовую принадлежность изолирован­ных анаэробных культур. На втором этапе проводят окончательную идентификацию до вида по биохими­ческим тестам, антигенным свойствам и по изучению конечных продуктов бактериального метаболизма в среде культивирования с помощью метода ГЖХ.

При идентификации анаэробов до рода учитывают­ся культуральные, морфологические и тинкториаль-ные свойства, а также фенотипы исследуемых культур по отношению к анаэродискам. Анаэродиски — это диски, пропитанные антибиотиками, желчью и брил­лиантовым зеленым. Обычно используют следующие анаэродиски: канамицин — 1000 мкг/мл, пеницил­лин — 2 ЕД, полимиксин В — 100 ЕД, эритроми­цин — 60 мкг/мл, рифампицин — 15 мкг/мл, ристо-мицин — 5 мкг/мл, желчь — 5 мг/мл и диск с брил­лиантовым зеленым — 100 мкг. Ориентировочную родовую идентификацию проводят, сравнивая полу­ченный фенотипический профиль с таблицей фено-типических профилей анаэробных микробов.

Зная ориентировочную родовую принадлежность анаэробного микроба, его вид определяют с помо­щью биохимических тестов, а в случае необходи­мости — и по конечным продуктам бактериального

метаболизма, выделяемым в среду культивирования с помощью ГЖК-метода.

Газовая хроматография. Бактериологическое исследование на анаэробы длительно, тру­доемко и дорого. Время, затрачиваемое с момента доставки материала в микробиоло­гическую лабораторию до получения пол­ного развернутого ответа, составляет от 7 до 10 суток, что абсолютно не удовлетворяет требованиям клиницистов. Это обусловлено медленным ростом, а также необходимостью изучения многочисленных таксономических признаков при идентификации выделенных чистых культур.

Использование метода ГЖХ для экспресс-диагностики анаэробной инфекции осно­вано на хроматографическом определении в исследуемом материале специфических продуктов метаболизма анаэробов — лету­чих жирных кислот, которые служат метабо­лическими маркерами наличия анаэробов. Конечными высокоспецифичными продук­тами метаболизма углеводов у анаэробов яв­ляются жирные кислоты. Различают корот-коцепочечные или летучие жирные кислоты С₂-С₇ и длинноцепочечные нелетучие кис­лоты. Определение в исследуемом материале наличия жирных кислот с помощью ГЖХ яв­ляется убедительным доказательством анаэ­робной этиологии воспалительного процес­са. Методом ГЖХ технически более просто определять летучие жирные кислоты. При этом метаболическими маркерами анаэробов являются изомасляная и масляная, изовале-риановая и валериановая, изокапроновая и капроновая, гексановая и каприловая кис­лоты. Аэробные бактерии летучие жирные кислоты не продуцируют.

Для хроматографического анализа проводят экс­тракцию летучих жирных кислот эфиром или другими летучими органическими растворителями. Экстракт вводят в хроматограф. Чувствительность метода — Ю^-6 г/л; время анализа — 30-50 мин. Идентификацию летучих жирных кислот осуществляют по относи­тельному времени удерживания, для сравнения ис­пользуют аналитические стандарты жирных кислот. Обнаружение в исследуемом материале одной или нескольких летучих жирных кислот, особенно изокис-лот с разветвленной углеродной цепочкой, является убедительным доказательством наличия анаэробов.

Для получения более подробной информации о метаболической активности анаэробов определяют длинноцепочечные жирные кислоты, которые пере­водят в летучие производные, например метиловые эфиры, многоатомные спирты, ароматические соеди­нения, углеводные соединения, аминосахара, ами­нокислоты, пурины и т. п. Наличие в исследуемом материале длинноцепочечных жирных кислот также является убедительным доказательством анаэробной природы воспалительного процесса. Анализ метило­вых эфиров жирных кислот необходим, если в пробе отсутствуют летучие жирные кислоты или определя­ется только одна уксусная кислота.

Наличие в исследуемом материале только уксус­ной или пропионовой кислоты не может служить достоверным доказательством наличия анаэробов, так как эти кислоты могут продуцироваться неко­торыми факультативными анаэробами, такими как Staphylococcus aureus, Esherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella spp. Обнаружение в патологическом мате­риале только молочной или яблочной жирных кислот также не может быть веским доказательством нали­чия анаэробов, так как эти кислоты являются нор­мальными метаболитами тканей человека.

Очень важное значение при индикации ана­эробов в патологическом материале приоб­ретают ложноположительные и ложноотрица-тельные результаты ГЖХ-анализа. Под ложно-положительными результатами ГЖХ-анализа понимают такие результаты, когда на хрома-тограмме присутствуют пики жирных кислот, а бактериологически облигатные анаэробные бактерии не выделяются. Под ложноотрица-тельными результатами ГЖХ-анализа понима­ют такие результаты, когда на хроматограмме отсутствуют пики жирных кислот, хотя анаэ­робы присутствуют в изучаемой пробе и могут быть выделены бактериологически.

Причины ложных результатов ГЖХ-анали­за при исследовании на анаэробы приведены в табл. 15.2.