Культивирование и индикация вирусов

Культивирование вирусов человека и животных проводят с целью лабораторной диагностики вирусных инфекций, для изучения вопросов патогенеза и иммунитета, получения диагностических и вакцинных препаратов, применяют в научно-исследовательской работе. Поскольку вирусы являются абсолютными паразитами, их культивируют или на уровне организма, или на уровне живых клеток, выращиваемых вне организма в искусственных условиях. В качестве биологических моделей для культивирования используют лабораторных животных, развивающиеся куриные эмбрионы и культуры клеток. Лабораторные животные (белые мыши, хлопковые крысы, кролики, хомяки, обезьяны и др.) в начальный период развития вирусологии были единственной экспериментальной биологической моделью, которую использовали для размножения и изучения свойств вирусов. На основании развития типичных признаков заболевания и патоморфологических изменений органов животных можно судить о репродукции вирусов, т. е. проводить индикацию вирусов. В настоящее время применение этой модели для диагностики ограничено из-за невосприимчивости животных ко многим вирусам человека.

Куриные эмбрионы предложены в качестве экспериментальной модели для культивирования вирусов в середине 30-х годов Ф. Бернетом. К достоинствам модели относятся возможность накопления вирусов в больших количествах, стерильность объекта, отсутствие скрытых вирусных инфекций, простота техники работы. Для культивирования вирусов исследуемый материал вводят в различные полости и ткани куриного зародыша.

Индикацию вирусов осуществляют по характеру специфических поражений оболочек и тела эмбриона, а также феномену гемагглютинации – склеиванию эритроцитов. Явление гемагглютинации впервые было обнаружено в 1941 г. при культивировании в куриных эмбрионах вирусов гриппа. Позднее было установлено, что гемагглютинирующими свойствами обладают многие вирусы. На основе этого феномена была разработана техника реакции гемагглютинации (РГА) вне организма (in vitro), которая широко применяется для лабораторной диагностики вирусных инфекций. Куриные эмбрионы не являются универсальной биологической моделью для вирусов. Почти неограниченные возможности появились у вирусологов после открытия метода выращивания культур клеток.

Метод культур клеток – выращивание различных клеток и тканей вне организма на искусственных питательных средах -разработан в 50-х годах Дж. Эндерсом и сотр. Подавляющее большинство вирусов способно размножаться на культурах клеток. Для: приготовления культур клеток используют самые разнообразные ткани человека, животных и птиц. Большое распространение получили культуры клеток из эмбриональных и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих по сравнению с нормальной тканью взрослого организма более активной способностью к росту и размножению.

В зависимости от техники приготовления и культивирования различают три основных типа культур клеток и тканей: однослойные культуры клеток; культуры суспензированных клеток; органные культуры.

Наибольшее практическое применение получили однослойные культуры, растущие на поверхности стекла лабораторной посуды в виде монослоя клеток. Однослойные культуры клеток в зависимости от числа жизнеспособных генераций в свою очередь подразделяются на первичные, или первично-трипсинизированные (способны размножаться однократно), перевиваемые, или стабильные (способны перевиваться в лабораторных условиях в течение неопределенно длительного срока), и полуперевиваемые (способны размножаться в течение 40-50 пассажей).; Культуры суспензированных клеток растут и размножаются во взвешенном состоянии при постоянном интенсивном перемешивании среды. Они могут быть использованы для накопления большого количества вирусов. Некоторые вирусы лучше размножаются в органных культурах, которые представляют собой кусочки органов животного или человека, выращиваемых вне организма и сохраняющих свойственную данному органу структуру. В зависимости от свойств вируса подбирают наиболее чувствительную к данному вирусу культуру клеток, на которой возможна его репродукция. О размножении вирусов в культуре клеток свидетельствуют I следующие признаки:

§ цитопатический эффект;

§ образование в клетках включений;

§ образование бляшек;

§ феномен гемадсорбции;

§ «цветная» реакция.

Цитопатический эффект (ЦПЭ) – видимые под микроскопом морфологические изменения клеток вплоть до их гибели, возникающие в результате повреждающего действия вирусов. Характер ЦПЭ, вызванного разными вирусами, неодинаков. Включения представляют собой скопления вирусных частий, вирусных белков или клеточного материала, которые можно обнаружить в ядре или цитоплазме клеток при специальных методах окраски. Бляшки, или «негативные колонии» вирусов, – участки разрушенных вирусами клеток; их можно обнаружить при культивировании вирусов на однослойных клеточных культурах, покрытых тонким слоем агара. Бляшки, образуемые разными вирусами, отличаются по величине, форме, времени появления, поэтому феномен бляшко-образования используют для дифференциации вирусов. Реакция гемадсорбции – способность клеточных культур, зараженных вирусом, адсорбировать на своей поверхности эритроциты. Механизмы реакций гемадсорбции и гемагглютинации сходны. Многие вирусы обладают гемадсорбирующими свойствами. «Цветная» реакция основана на разнице в цвете индикатора питательной среды, используемой для культур клеток. При росте клеток, не пораженных вирусом, накапливаются продукты метаболизма, что приводит к изменению цвета индикатора питательной среды. При репродукции вирусов в культуре нарушается нормальный метаболизм клеток и среда сохраняет первоначальный цвет.