Умови і етапи біосинтезу білка

Трансляція і загальні вимоги до синтезу білка в безклітинній системі.

Пряме відношення до механізмів передачі спадкової інформації має процес трансляції, що означає переклад " чотирьохбуквеної мови нуклеїнових кислот на двадцатилітерну мову білків". Іншими словами, трансляція зводиться до синтезу білка в рибосомах; у цьому синтезі послідовність розташування нуклеотидів в мРНК визначає первинну структуру білка, тобто строго впорядковану послідовність розташування окремих амінокислот в молекулі білка, що синтезується.

При визначенні радіоактивності білків в різних субклітинних фракціях печінки, отриманих методом диференціального центрифугування через різні проміжки часу, було показано, що радіоактивна мітка в першу чергу з'являється у фракції мікросом і лише потім в інших субклітинних утвореннях. Після встановлення місця включення радіоактивної мітки було з'ясовано участь інших субклітинних фракцій і низькомолекулярних клітинних компонентів в синтезі білка. При інкубації мікросом печінки щурів з 14С-лизином включення радіоактивної мітки в білки рибосом спостерігалося за наявності в системі, крім фракції мікросом, ще деяких розчинних компонентів цитоплазми, джерела енергії у формі АТФ системи, а також ГТФ.

Подальші дослідження були направлені на пошук інших компонентів белоксинтезирующей системи.

Білоксинтезуюча система включає: набір всіх 20 амінокислот, що входять до складу білкових молекул; мінімум 20 різних тРНК, що володіють специфічністю до певного ферменту і амінокислоти; набір мінімум 20 різних ферментів - аміноацил-тРНК-синтетаз, що також володіють подвійною специфічністю до якої-небудь певної амінокислоти і одній тРНК; рибосоми (точніше за полісому: що складаються з 4-12 монорибосом з приєднаною до них матричною мРНК); АТФ і АТФ-ГЕНЕРІРУЮЩУЮ систему ферментів; ГТФ, що бере специфічну участь в ініціації і елонгації синтезу білка в рибосомах; іони Mg2+ в концентрації 0, 005-0, 008 М; мРНК як головний компонент системи, що несе інформацію про структуру білка, що синтезується в рибосомі; нарешті, білкові чинники, що беруть участь в синтезі на різному рівні трансляції.

Розглянемо детальніше структуру і функцію головних компонентів белоксинтезирующей системи.

Рибосоми

Живі організми, як відомо, залежно від структури кліток діляться на дві групи: прокариоты і эукариоты. Перші не містять обмеженого мембраною ядра і мітохондрій або хлоропластів; вони представлені головним чином мікроорганізмами. Клітки еукаріот тварин і рослин, включаючи гриби, навпаки, містять ядра з мембранами, а також мітохондрії (і у ряді випадків хлоропласти).

Обидва типи кліток містять рибосомы, причому рибосомы эукариот (клітки тварин) приблизно в два рази більше рибосом прокариот (бактерії). Зазвичай рибосоми характеризують за швидкістю їх седиментації у центрифужному полі, яка кількісно виражається константою седиментації s, що виражається в одиницях Сведберга S.

Величина s залежить не тільки від розміру частинок, але і від форми і щільності, так що вона не пропорційна розміру. Число рибосом в мікробній клітці приблизно рівне 104, а эукариот — близько 105.

Хімічно рибосоми є нуклеопротеїнами, що складаються тільки з РНК і білка, причому 80S рибосоми еукаріот містять приблизно рівну їх кількість, а у 70S рибосом прокаріот співвідношення РНК і білка складає 2: 1. РНК рибосом прийнято називати рибосомним і позначати рРНК. Як 80S, так і 70S рибосоми складаються з двох субчастинок; це можна за допомогою електронної мікроскопії або шляхом обробки рибосом розчинами, що містять низькі концентрації іонів Mg2+. За цих умов рибосомы дисоціюють на субчастинки; останні можуть бути відокремлені один від одного методом ультрацентрофугування. Одна з субчастинок по розмірах в 2 рази перевищує розмір другої; так, у 70S рибосом величини S для субчастинок рівні 50S і 30S, у 80S рибосом, відповідно 60S і 40S. Субчастинки рибосом кліток еукаріот влаштовані складніше: більше 70 різних білків в обох субчастинках, при цьому велика субчастинка містить 28S, 5, 8S і 5S рРНК, а мала містить 18S рРНК (До теперішнього часу повністю розшифрована первинна структура всіх рРНК в 70S і 80S рибосомах і амінокислотній послідовності всіх 55 білків 70S рибосом і частково білків 80S рибосом.).

Для з'ясування тонких молекулярних механізмів синтезу білка в рибосомах необхідні відомості про структуру і функції рибосом. Останнім часом отримані дані, що свідчать про вірогідну просторову тривимірну структуру як цілих рибосом, так і їх субчастинок. Зокрема, з'ясовано, що форму і розміри 30S і 40S рибосом зумовлюють не білкові молекули цих частинок, а третинна структура що входять в їх склад 16S і 18S рРНК. Більш того, за даними акад. А.С. Спірина, для збереження просторової морфологічної моделі всієї 30S субчастинки виявилася достатньою наявність тільки двох білків, що містяться в певних топографічних ділянках молекули 16S рРНК.

Щодо походження рибосом відомо, що рРНК походить із загального попередника всіх клітинних РНК, що у свою чергу синтезується на матриці ДНК в ядрі; рибосомні білки мають походження цитоплазми, потім вони транспортуються в ядерця, де і відбувається спонтанне утворення рибосомних субчастинок шляхом об'єднання білків з відповідними рРНК. Об'єднані субчастинки разом або нарізно транспортуються через пори ядерної мембрани назад в цитоплазму, де ряд рибосом разом з мРНК утворюють полісоми або полірибосоми.

Аміноацил-тРНК-синтетази

Експериментально доведено існування в будь-яких клітках живого організму специфічних ферментів, що каталізують активування амінокислот і скріплення останніх з певними тРНК. Всі ці ферменти виділені в чистому вигляді з E. coli.

Молекулярна маса майже всіх синтетаз рівна 100 000 Так, за винятком фенілаланін-тРНК-синтетази (180 000 Так). Всі вони виявилися чутливими до реагентів на SH-группы і вимагають присутності іонів Mg2+. Ферменти володіють абсолютною специфічністю дії, оскільки вони дізнаються тільки одну яку-небудь L-амінокислоту або одну тРНК; ця обставина надзвичайна важливо, оскільки надалі в білковому синтезі " пізнавання" аміноацил-тРНК засноване не на природі амінокислоти, а на хімічній природі антикодону тРНК. Вважається, що в молекулі кожної аміноацил-тРНК-синтетази є принаймні три центри скріплення: для амінокислоти, тРНК і АТФ; ферменти вельми чутливі також до аналогів амінокислот, які інгібірують активування відповідних амінокислот. Деякі ферменти складаються з одного поліпептидного ланцюга, інші з двох або чотирьох гомологічних або гетерогенних субодиниць.

Аміноацил-трнк-синтетази в активному центрі містять гістидин, імідазольне кільце якого бере участь в скріпленні АТФ за допомогою іонів Mg2+. Найбільшою спорідненістю ці ферменти, як було вказано, володіють по відношенню до молекул специфічних тРНК, хоча конкретний механізм, за допомогою якого ферменти дізнаються відповідну РНК, поки не ясний. В той же час ці ферменти відрізняються низькою молярною активністю (число оборотів не перевищує декількох сотень каталітичних актів в хвилину).

Транспортні РНК

У лабораторії М. Хогланда було з'ясоване, що при інкубації 14С-аминокислоты з розчинної з розчинною фракцією цитоплазми в присутності АТФ і подальшим додаванням трихлороцетової кислоти в білковому осаді, що утворився, мітка не відкривається. Було зроблено висновок, що мічена амінокислота не включається в білкову молекулу. Мітка виявилася пов'язаною ковалентний з РНК, такою, що міститься в безбілковому фільтраті. Показано, що РНК, до якої приєднується мічена амінокислота, має невелику молекулярну масу і зосереджена в розчинній фракції, тому її спочатку назвали розчинною, а потім адапторною або транспортною РНК (тРНК). Трнк припадає на частку приблизно 10 — 15 % загальної кількості клітинної РНК. До теперішнього часу відкрито більше 60 різних тРНК. Для кожної амінокислоти в клітці є принаймні одна специфічна РНК (для ряду амінокислот відкрито більш за одну, зокрема, для серину — 5 різних тРНК, для лізину і гліцину — по 4 різних тРНК, хоча і в цьому випадку кожна тРНК пов'язана із специфічною аміноацил-тРНК-синтетазою). Молекулярна маса більшості тРНК коливається від 24 000 до 29 000 Так. Вони містять від 75 до 85 нуклеотидов. Амінокислоти приєднуються до вільної 3'-OH-групі кінцевого мононуклеотіду, представленого у всіх тРНК АМФ, шляхом утворення ефірного зв'язку. Цікаво, сто всі тРНК володіють не тільки дивно схожими функціями, але і дуже схожою тривимірною структурою.

Встановлена первинна структура майже всіх 60 відкритих тРНК; знання послідовності, а отже, складу тРНК дало в руки дослідників багато цінних відомостей про біологічну роль окремих компонентів тРНК. Загальною для тРНК виявилася також нативна конформація, встановлена методом рентгеноструктурного аналізу і названа спочатку конформацією конюшинового листа; насправді ця конформація має неправильну, Г-подібну форму.

Визначення структури тРНК дозволило виявити ряд відмітних ділянок; так, на 3'-гидроксильном кінці розташовується однакова для всіх тРНК послідовність триплета ЦЦА-ОН, до якої приєднується за допомогою ефірного зв'язку специфічна амінокислота. Скріплення в основному відбувається через 3'-ОН- групу кінцевого аденілового нуклеотиду, хоча отримані докази можливості приєднання амінокислоти через 2'-ОН- групу. Тимін-псевдоуридін-цитиділова (Т(Ц) петливши, мабуть, зв'язує аміноацил-тРНК з поверхнею рибосоми. Є, крім того, додаткова петля, склад якої варіюється у різних типів молекул тРНК; її призначення невідоме. Дигідроуріділова петливши, з іншого боку, виявилася необхідною як сайт (місце) для пізнавання специфічним ферментом — аміноацил-тРНК-синтетазой. Є також антикодонова петливши, що несе триплет, названий антикодоном, і розташована на протилежній стороні від того кінця, куди приєднується амінокислота. Антикодон є специфічним і комплементарним до відповідного кодону мРНК, причому обидва вони є антипаралельними в своїй комплементарності.

Ретельний аналіз нуклеотидных послідовностей різних тРНК показав, що всі вони містять однаковий 5'-кінцевий нуклеотід — ГМФ з вільною 5'-фосфатной групою. Адапторна функція молекул тРНК полягає в пов'язанні кожної молекули тРНК зі своєю амінокислотою. Але оскільки між нуклеїновою кислотою і специфічною функціональною групою амінокислоти не існує відповідності і спорідненості, цю функцію пізнавання повинна виконувати білкова молекула, яка дізнається як молекулу специфічної тРНК, так і специфічної амінокислоти.