цКЮБМЮЪ ЯРПЮМХЖЮ яКСВЮИМЮЪ ЯРПЮМХЖЮ
йюрецнпхх:
юБРНЛНАХКХюЯРПНМНЛХЪаХНКНЦХЪцЕНЦПЮТХЪдНЛ Х ЯЮДдПСЦХЕ ЪГШЙХдПСЦНЕхМТНПЛЮРХЙЮхЯРНПХЪйСКЭРСПЮкХРЕПЮРСПЮкНЦХЙЮлЮРЕЛЮРХЙЮлЕДХЖХМЮлЕРЮККСПЦХЪлЕУЮМХЙЮнАПЮГНБЮМХЕнУПЮМЮ РПСДЮоЕДЮЦНЦХЙЮоНКХРХЙЮоПЮБНоЯХУНКНЦХЪпЕКХЦХЪпХРНПХЙЮяНЖХНКНЦХЪяОНПРяРПНХРЕКЭЯРБНрЕУМНКНЦХЪрСПХГЛтХГХЙЮтХКНЯНТХЪтХМЮМЯШуХЛХЪвЕПВЕМХЕщЙНКНЦХЪщЙНМНЛХЙЮщКЕЙРПНМХЙЮ
нАБЛЮДЕНИЯ ЗА ЭКЗОЦИТОЗОМ И ЭНДОЦИТОЗОМ В ЖИВЫХ КЛЕТКАХ
|
|
Аналогичные эксперименты были проведены с использование высоко флуоресцентных меток для маркировки рециклированных везикул83). Внедренная Бетцом и коллегами, эта методика дает то важное преимущество, что кругооборот везикул можно наблюдать в живом препарате по вызываемым стиму-
236 Раздел П. Передача информации в нервной системе
 
Fig. 11.21. Recycling of Specific Synaptic Vesicle Membrane Proteins. (A-C) Fluorescence micrographs of frog neuromuscular junctions labeled with antibodies to synaptophysin (a vesicle membrane protein) and fluorescein-conjugated second antibodies. (D, E) Electron micrographs of cross sections of neuromuscular junctions. (A) Normal junction. The axon terminal membrane must be made permeable with detergent in order for antibodies to reach synaptophysin. (B, D) Muscle was treated with a-latrotoxin, which causes quanta! transmitter release in the absence of calcium. This was done in calcium-free medium, which blocks endocytosis. Under these conditions, axon terminals are depleted of synaptic vesicles, appear distended, and stain without being made permeable. This indicates that synaptic vesicles have fused with the terminal membrane during exocytosis while retrieval of vesicle membrane was blocked, leaving synaptophysin exposed on the surface. (C, E) Muscle was treated with o-latrotoxin in normal saline. Terminals have a normal appearance and can be stained only after being made permeable. Under these conditions the vesicle population is maintained by active recycling while more than two times the initial store of quanta is released. Thus, despite the active turnover of synaptic vesicles, no detectable synaptophysin remains on the terminal surface, demonstrating the specificity and efficiency of synaptic vesicle membrane retrieval. (From Valtorta et al., 1988; micrographs kindly provided by F. Valtorta.)
| Рис. 11.21. Вторичное использование специфических белков мембраны синаптических везикул. (А-С) Флуоресцентные микрографии нервно-мышечных соединений лягушки, окрашенных антителами к синаптофизину (белок везикулярной мембраны) и вторичными антителами, конъюгированными с флюоресцеином. (О, Е) Электронные микрофотографии поперечных срезов нервно-мышечных соединений. (А) Нервно-мышечное соединение в контроле. Мембрана аксонного окончания должна быть обработана детергентом, чтобы стать проницаемой для антител, связывающихся с синаптофизином. (В, D) Мышца была обработана a-латротоксином, который способен вызвать высвобождение медиатора в отсутствии кальция. Последующий зндоцитоз был предотвращен путем убирания кальция из наружного раствора. В этих условиях запас синаптических везикул в аксонных окончаниях истощается, окончания раздуваются и их можно окрасить даже без предварительной обработки детергентом. Это указывает на то, что синаптические везикулы сливаются с мембраной в процессе экзоцитоза, что в условиях заблокированного обратного захвата везикулярной мембраны приводит к длительному нахождению синаптофизина на поверхности клетки. (С, Е) Мышца была обработана a-латротоксином в нормальном растворе. Окончания выглядят нормально и могут быть окрашены только после обработки детергентом. В этих условиях популяция везикул поддерживается активным рециклированием, в то время как из окончания высвобождается в два раза больше квантов, чем их было в самом начале. В результате, несмотря на активное использование синаптических везикул, на поверхности окончания не обнаруживается следов синаптофизина, что демонстрирует специфичность и эффективность механизма обратного захвата везикулярной мембраны. |
ляцией накоплению и высвобождению метки (рис. 11.23). Эти исследования позволили обнаружить, что в нормальных физиологических условиях полный цикл экзоцитоза обратного захвата и формирования новых синаптических везикул занимает менее 1 минуты 84) -- 86); восстановление же после более интенсивной стимуляции происходит медленнее 79). Более
Глава 11. Высвобождение медиатора 237
| Рис. 11.22. Предполагаемые пути мембранного захвата в процессе вторичного использования везикул. После экзоцитоза везикулы, покрытые клатрином, селективно захватывают компоненты везикулярной мембраны. Новые синаптические везикулы образуются из покрытых везикул либо напрямую, либо через эндосомы. После интенсивной стимуляции наблюдается захват из непокрытых углублений в мембране, а также из цистерн. Новые синаптические везикулы, образовавшиеся из рециклированием мембраны, заполняются нейромедиатором и могут быть высвобождены при стимуляции. | 
Fig. 11.22. Proposed Pathways for Membrane Retrieval during vesicle recycling. After exocytosis, clathrin-coated vesicles selectively recapture synaptic vesicle membrane components. New synaptic vesicles are formed from coated vesicles, either directly or through endosomes. After intense stimulation, retrieval occurs from uncoated pits and cisternae. The new synaptic vesicles formed from recycled membrane are filled with transmitter and can be released by stimulation.
|
| Рис. 11.23. Вызываемые активностью захват и высвобождение флуоресцентной метки в аксонных окончаниях нервно-мышечного соединения лягушки. Флуоресцентные микрографии аксонных окончаний в кожно грудин ной мышце. (А) Мышца была обработана флуоресцентной меткой (FM 1-43, с концентрацией 2 мкмоль) в течение 5 минут и затем отмывалась на протяжении 30 минут. Лишь небольшое количество метки остается связанной с мембраной окончания. (В) Та же мышца была далее обработана меткой в течение 5 минут, в то время как нерв стимулировался с частотой 10 гЦ, и затем отмывалась на протяжении 30 минут. Флуоресцентные пятна являются кластерами синаптических везикул, которые были заполнены меткой в процессе рециклирования. (С) Та же мышца затем стимулировалась 5 минут с частотой 10 Гц и затем отмывалась в течение 30 минут. Fig. 11.23. Activity-Dependent Uptake and Release of fluorescent dye by | 
axon terminals at the frog neuromuscular junction. Fluorescence micrographs of axon terminals in a cutaneous pectoris muscle. (A) Muscle was bathed for 5 min in fluorescent dye (2 μ Μ FM1-43) and washed for 30 min. Only small amounts of dye remain associated with the terminal membrane. (B) The same muscle was then bathed in dye for 5 min while the nerve was stimulated (10 Hz) and washed for 30 min. The fluorescent patches are clusters of synaptic vesicles that were filled with dye during recycling. (C) The same muscle was then stimulated at 10 Hz for 5 min and washed for 30 min. Stimulation released most of the dye. (Micrographs kindly provided by W. J. Betz.)
|
того, было показано, что захват флуоресцентных меток в пресинаптические бутоны культивируемых гиппокампалъных нейронов происходит квантовым образом, причем размер каждого кванта соответствует захвату одной синаптической везикулы87). Такого рода квантовый захват происходит в течение секунд после начала стимуляции, предполагая.
238 Раздел II. Передача информации в нервной системе
| Рис. 11.24. Высвобождение медиатора и захват везикулярной мембраны, регистрируемый по изменению мембранной емкости. Увеличение емкости клетки при регистрации пэтч-электродом в конфигурации от целой клетки имеет ступенчатый характер, отражая слияние отдельных везикул с плазматической мембраной. Уменьшение емкости происходит при обратном захвате везикул. Fig. 11.24. Release and Retrieval of Vesicle Membrane monitored by changes in membrane capacitance. | 
Increases in celt capacitance measured with the whole-cell patch pipette recording technique occur in a stepwise fashion reflecting the fusion of individual vesicles with the plasma membrane. Corresponding decreases in capacitance are seen during vesicle retrieval. The recordings are from a rat mast cell, which has particularly large secretory vesicles (800 nm in diameter). (After Fernandez, Neher, and Gomperts, 1984.)
|
что одиночные события экзоцитоза и эндоцитоза очень близко связаны. Эта методика позволяет анализировать квантовое высвобождение из отдельных пресинаптических бутонов без регистрации постсинаптических ответов. Поскольку регистрирующие электроды не нужны, эти оптические методы оказываются весьма удобными при исследовании пресинаптической функции и долговременной пластичности.
Многообещающим подходом для исследований экзоцитоза везикул является использование не нейрональных секреторных клеток, например, клеток молочной железы и хромаффинных клеток, в которых экзоцитоз больших и плотных секреторных гранул может быть исследован одновременно с помощью световой микроскопии, электрофизиологической регистрации и амперометрии, которая позволяет детектировать амины, выделяемые этими клетками88·89'. Слияние одиночных гранул с плазматической мембраной может быть зарегистрировано пэтч-электродом в виде увеличения электрической емкости клетки, которое возникает при добавлении мембранных гранул к клеточной поверхности; обратный же захват мембраны при эндоцитозе приводит к уменьшению емкости (рис. 11.24)90). Алмерс с соавторами в экспериментах на хромаффинных клетках добавили электрод из угольного волокна внутрь пэтч-электрода, чтобы измерить высвобождение катехоламинов, содержащихся в гранулах91'. Высвобождение обычно детектировалось одновременно с увеличением емкости, как это можно было бы предположить в случае экзоцитоза и включения гранулярной мембраны в плазматическую (рис. 11.25). Однако примерно 15 % событий высвобождения сопровождались кратковременным и неполным увеличением емкости. В этих случаях экзоцитоз, по всей видимости, происходил через маленькое, открываемое на короткое время отверстие (fusion роге), которое затем быстро закрывалось, позволяя грануле отойти обратно в цитоплазму без включения ее в наружную мембрану (рис. 11.25D). Такие события типа «поцеловал и убежал» (kiss and run) могут позволить освобождаться маленьким молекулам, например, катехоламинам, чей запас может быть быстро восстановлен, но задерживать при этом большие белки, потеря которых может быть восполнена только путем синтеза абсолютно новых гранул в аппарате Гольджи.
Изменения емкости, связанные с высвобождением множественных квантов, были измерены в одиночных нервных окончаниях, выделенных из ЦНС позвоночных92· 93). Пока еще технически невозможно регистрировать изменение емкости, связанные со слиянием одиночных синаптических везикул. Хотя полное слияние синаптических везикул с пресинаптической мембраной явно происходит во время интенсивной стимуляции, остается неясным, может ли происходить в нормальных физиологических условиях высвобождение по механизму «поцеловать и убежать» 94, 95).
Глава 11. Высвобождение медиатора 239
|
| Рис. 11.25. Увеличение емкости мембраны и высвобождение катехоламинов из хромаффинных клеток. (А) Электрод, изготовленный из угольного волокна и расположенный внутри пэтч-электрода, измеряет высвобождение катехоламина амперометрическим способом, в то время как сам электрод используется для измерения емкости в пределах регистрируемого участка мембраны. (В) Одновременная регистрация высвобождения катехоламинов (вверху) и емкости (внизу). Все события экзоцитоза, зарегистрированные по высвобождению катехоламина, совпадают с увеличением емкости. (С) Шестое и седьмое события экзоцитоза (из части В рисунка) показаны на увеличенной временной шкале. Шестое событие экзоцитоэа совпадает с кратковременным и довольно шумящим увеличением емкости, которая длится около 5 с. Седьмое событие совпадает с быстрым и длительным увеличением емкости. (D) Кратковременное увеличение емкости может соответствовать зкзоцитозу через отверстие, образующееся при частичном слиянии везикул с мембраной, который длится короткое время, заканчиваясь отсоединением везикулы от мембраны и уходом обратно в цитоплазму без включения в плазматическую мембрану. В зтих условиях могут высвобождаться маленькие молекулы, в то время как большие белки остаются внутри везикулы. Fig. 11.25. Coincident Increases in Membrane Capacitance and Release of Catecholamines from chromaffin cells. (A) A carbon fiber electrode inside the patch pipette measures catecholamine release by amperometry, while at the same time the electrode is used to measure capacitance within the patch. (B) Simultaneous recording of catecholamine release (top trace) and capacitance (bottom trace). All exocytic events detected by catecholamtne release coincide with increases in capacitance. (C) The sixth and seventh exocytic events in part B, displayed on an expanded scale. The sixth exocytic event coincides with a transient flickering increase in capacitance that lasts about 5 s. The seventh exocytic event coincides with an abrupt and long-lasting increase in capacitance. (D) Transient increases in capacitance may correspond to exocytosis through a temporary fusion pore that rapidly closes, allowing the vesicle to pinch back off into the cytoplasm without ever becoming incorporated into the plasma membrane. Under such circumstances small molecules may be released while larger proteins are retained in the vesicle. (After Albillos et aL, 1997.) |
240 Раздел II. Передача информации в нервной системе
выводы
∙ Деполяризация окончания аксона приводит к открыванию потенциал-активируемых кальциевых каналов, увеличению внутриклеточной концентрации кальция и высвобождению медиатора.
∙ Медиатор высвобождается в виде мультимолекулярных квантов, что происходит при слиянии синаптических везикул, заполненных медиатором, с плазматической мембраной и высвобождении их содержимого путем экзоцитоза. Помимо этого существует также постоянная неквантовая утечка медиатора из окончаний аксонов в состоянии покоя.
∙ Синаптическая задержка между началом пресинаптической деполяризации и началом постсинаптического потенциала обусловлена временем, необходимым для деполяризации нервного окончания, открывания кальциевых каналов и увеличения внутриклеточной концентрации кальция, который запускает процесс экзоцитоза.
∙ В покое экзоцитоз происходит с низкой частотой, вызывая спонтанный миниатюрный синаптический потенциал. В ответ на потенциал действия от 1 до 300 квантов (в зависимости от типа синапса) высвобождается практически одновременно.
∙ Синаптические везикулы содержат несколько тысяч молекул медиатора. Количество постсинаптических рецепторов, активируемых одним квантом медиатора, варьирует значительно, в пределах от 15 до 1 500, в зависимости от типа синапсов.
∙ Распределение амплитуд спонтанных миниатюрных и вызванных постсинаптических потенциалов может быть проанализировано статистическими методами для определения размера кванта и квантового состава. Эффективность синаптической передачи может модулироваться на пресинаптическом уровне за счет изменения квантового состава, а также на постсинаптическом уровне за счет изменения размера кванта.
∙ В результате экзоцитоза мембраны синаптических везикул могут сливаться с плазматической мембраной. Компоненты везикулярной мембраны затем специфично захватываются обратно путем эндоцитоза покрытых везикул и рециклируются при формировании новых синаптических везикул. В определенных условиях высвобожденные везикулы могут возвращаться обратно в цитоплазму без включения в клеточную мембрану.