Механизм амплификации рибосомных генов

В диплоидной клетке лягушки имеются две гомологичные области генов больших рРНК. Каждая область содержит примерно 450 копий единиц

¹ Повторяющиеся гены – этогены, которые всегда присутствуют в геноме в большом числе копий; этот признак наследуется. Гены 5S-pPHK, представленные тысячами копий на геном, составляют набор повторяющихся генов. Амплифицированные гены – это гены, присутствующие в количестве многих копий только в определенных клетках. Эта множественность не наследуется. Гены для 28S-, 18S- и 5, 8S-pPHК – повторяющиеся (около 900 раз на 1 клетку) и амплифицированные (в ооците).

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

116 _______________ ГЛАВА 11 _______________________________________________________________________________

Рис. 11.8. Организация генов для рибосомных 18S-, 5, 8S- и 28S-РНК у амфибий. Каждая единица транскрипции (ET) фланкирована участками нетранскрибируемых спейсеров (НТС). Единица транскрипции содержит транскрибируемую лидерную последовательность (ТЛ), ген 18S-pPHK, транскрибируемый спейсер (ТС), ген 5, 8S-pPHK, другой транскрибируемый спейсер и ген 28S-pPHK. Под диаграммой показана электронная микрофотография тандемно расположенных генов рРНК, активно транскрибируемых в ооците тритона. В ходе транскрипции размер РНК постепенно увеличивается и одновременно синтезируется большое количество транскриптов (По Watson, 1976; фотография с любезного разрешения O.L.. Miller, Jr.j

транскрипции, описанных в предыдущем разделе, и внутри каждой области эти копии разделены не транскрибируемыми спейсерами. Все наборы генов рРНК на хромосоме идентичны, а нетранскрибируемые спейсеры даже на одной хромосоме разные по длине на разных участках. Можно было бы ожидать, что ооцит на стадии диплотены (когда репликация ДНК уже закончилась) будет содержать всего 4 х 450, или приблизительно 1800 генов, кодирующих рРНК. Но этого явно недостаточно! Вместо нескольких тысяч копий обнаруживается около миллиона генов рРНК. Видны не четыре ядрышка, а тысячи (рис. 11.9). Эти добавочные ядрышки лежат внутри ядра, но не присоединены к какой-либо хромосоме, как обычные ядрышки.

Сравнивая эффективность гибридизации радиоактивной 28S-pPHK ооцита с ДНК соматической клетки, исследователи определили, что в ооците генов рРНК в 1500 раз больше, чем обычно. Если каждое ядрышко содержит 450 копий генов, то общее число генов для предшественников больших рРНК в ооците амфибий можно оценить как 6, 8 х 10⁵. Амплификацию можно изучать также с помощью метода центрифугирования в градиенте хлорида цезия. При центрифугировании фрагментированной ДНК в таком градиенте фрагменты седиментируют в соответствии со своей плавучей плотностью. Плавучая плотность ДНК из соматических клеток X. laevis составляет в среднем 1, 699 г см^–3. Распределение по плотности для фрагментированной ДНК из ооцитов несколько отличается (рис. 11.10). В этом случае наблюдается второй или «сателлитный» пик, обусловленный содержанием ДНК из амплифицированных генов рРНК. Состав осно-

Рис. 11.9. Ядро, изолированное из ооцита Xenopus laevis. Темно-окрашенные пятна представляют собой экстрахромосомные ядрышки. (Из Brown, Dawid, 1968; фотография с любезного разрешения D.D. Brown.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ИЗМЕНЕНИЕ ТРАНСКРИПЦИИ В ХОДЕ РАЗВИТИЯ _______________________________________ 117

Рис. 11.10. Выделение экстрахромосомных (амплифицированных) ядрышек. Из ядер соматических клеток и ядер ооцитов была изолирована ДНК; каждый препарат смешивали со стандартным количеством дАТ (для нормирования результатов) и центрифугировали в хлориде цезия до достижения равновесия. В обоих случаях основная фракция ДНК имела плотность 1, 699 г·см –3. Помимо этой ДНК в ооцитах содержалась «сателлитная» фракцияс большей плотностью. (По Brown, Dawid, 1968.)

ваний этой ДНК придает ей большую плавучую плотность (1, 729 г см^–3), чем плотность основной массы ДНК Xenopus. ДНК из клеток X. laevis имеет в среднем 40% ГЦ-пар, тогда как рибосомные гены - 67% ГЦ-пар. Поэтому рибосомные гены характеризуются большей плотностью, чем большинство других генов. В соматических тканях рибосомные гены составляют лишь 0, 06% генома и не образуют заметного отдельного сателлитного пика. Однако, когда эти гены амплифицированы в 1500 раз, они образуют зону тяжелой ДНК, легко отличимую от основной зоны. Эта ДНК будет гибридизоваться только с рибосомной ДНК, но не с другими генами. Не вызывает сомнений, что мы наблюдаем специфическую амплификацию гена – амплификацию, которая позволяет транскрибировать чрезвычайно большое количество РНК (Brown, Dawid, 1968).

Следующий интересующий нас вопрос как происходит амплификация этих генов? И хотя нам неизвестны детали механизма амплификации, мы располагаем некоторыми подходами к его выяснению. Мы знаем, например, что экстрахромосомные ядрышки образуются на стадии пахитены в профазе мейоза непосредственно перед диплотеной. В самом деле, для этой стадии характерна «пахитенная шапочка», которая представляет собой большую массу экстрахромосомной ДНК. Таким образом, добавочные гены синтезируются на стадии пахитены мейоза и транскрибируются на стадии диплотены. Когда ядро ооцита дезинтегрируется в ходе первого деления мейоза, добавочные ядрышки выходят в цитоплазму и разрушаются.

Один из наиболее интересных подходов к механизму амплификации связан с тем, что в каждом отдельном экстрахромосомном ядрышке участки нетранскрибируемых спейсеров имеют одинаковую длину (Wellauer et al., 1976). Однако среди хромосомных кластеров генов в одних и тех же клетках имеется заметная гетерогенность по длине спейсеров, поэтому экстрахромосомные ядрышки не являются простыми копиями всего хромосомного ядрышка. Одна из моделей, с помощью которой можно объяснить образование сотен транскрипционных единиц рибосомных генов, разделенных идентичными нетранскрибируемыми спейсерами, это модель катящегося кольца. Аналогичный механизм

Рис. 11.11. Модель репликации по механизму «катящегося кольца», при которой можно синтезировать много идентичных копий. Кольцо должно содержать одну единицу транскрипции рРНК и один нетранскрибируемый спейсер С помощью этого механизма могут быть созданы экстрахромосомные ядрышки с одинаковыми по длине участками НТС между генами.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

118 _______________ ГЛАВА 11 ___________ _______________________________________________________________

Рис. 11.12. Изолированная экстрахромосомная рРНК из ооцитов Xenopus laevis. На электронных микрофотографиях видны кольца (А) и «лариаты» (структуры типа лассо) (Б), что указывает на репликацию по механизму «катящегося кольца». (Из Rochaix et al., 1974; фотография с любезного разрешения A. Bird.)

репликации характерен для многих вирусов. В ооците один набор рибосомных генов каким-то образом отсоединяется от хромосомы и сворачивается в кольцо. В кольцо вводится ник (разрыв одной цепи), и с этого ника начинается синтез ДНК в обоих направлениях. Таким путем могут быть синтезированы идентичные копии рибосомных генов и их спейсеров (рис. 11.11). Электронные микрофотографии амплифицированных генов (Hourcade et al., 1973; Rochaix et al., 1974) подтверждают эту модель. На этих микрофотографиях выявляются замкнутые кольца, типичные для экстрахромосомных ядрышек, а также структуры типа «лариатов» (лассо), которые, по-видимому, представляют собой промежуточные продукты катящегося кольца (рис. 11.12).