Метилирование ДНК. Нередко полагают, что ген состоит из одних и тех же нуклеотидов, когда он активен и когда он неактивен

Нередко полагают, что ген состоит из одних и тех же нуклеотидов, когда он активен и когда он неактивен. Ген ß -цепи глобина в предшественнике эритроцитов должен иметь те же нуклеотиды, что и ген ß -цепи глобина в фибробласте того же организма. В 1948 г. в ДНК было открыто «пятое основание» 5- метил цитозин (Hotchkiss, 1948). Это основание образуется ферментативным путем после репликации ДНК, и около 5% цитозинов в ДНК млекопитающих переводится в 5-метилцитозин. Эта конверсия может происходить только в том случае, когда за цитидиновым остатком следует гуанозин (Ц ф Г). Недавние исследования показали, что степень метилирования цитозинов в гене может контролировать его транскрипцию. Другими словами, метилирование ДНК может менять структуру гена и благодаря этому регулировать его активность.

Первые данные о том, что метилирование ДНКпомогает регулировать активность генов, были получены в исследованиях, показавших корреляцию между активностью гена и его неметилированием (гипометилированием), особенно в области промотора гена. В развивающихся эритроцитах человека и курицы ДНК, участвующаяв синтезе глобинов, полностью или почти полностью неметилирована, тогда как те же гены в клетках, которые не синтезируют глобины, метилированы в высокой степени (рис. 12.19. А). Клетки печени плода, которые синтезируют гемоглобин на ранних стадиях развития. имеют неметилированные гены для фетального гемоглобина. Эти гены становятся метилированными в тканях взрослого организма (van der Ploeg, Flavell, 1980; Groudine, Weintraub, 1981).

Специфическое для органа метилирование наблюдается также в гене овальбумина курицы, этот ген не метилирован в клетках яйцевода, но метилирован в других тканях курицы (Mandel, Chamhon, 1979). Деметилирование сопровождает переключение классов при синтезе иммуноглобулинов (Rogers, Wall, 1981) и коррелирует со способностью грызунов продуцировать металлсвязывающий белок металлотионеин 1 (Compere, Palmiter, 1981). Таким образом, отсутствие метилирования ДНК хорошо коррелирует с тканеспецифической экспрессией определенных генов.

Вторая группа данных, свидетельствующих о том, что метилирование ДНК является регуляторным процессом, получена в опытах, где экспрессию клонированных генов изменяли с помощью введения или удаления метильных групп из остатков цитозина. Один из таких опытов еще раз подтвердил, что гипометилирование необходимо для транскрипции β -глобинового гена человека (Busslinger et al., 1983). Когда глобиновые гены клонировали и добавили к клеткам с помощью переосаждения с фосфатом кальция, клетки захватывали ДНК и нередко включали эту ДНК в ядра. В таких случаях клонированный глобиновый ген транскрибировался. С помощью защиты от метилирования определенных участков клонированных генов перед их добавлением к клеткам можно получить клоны, в которых глобиновые гены имеют идентичные последовательности, но разный характер метилирования (рис. 12.19. Б). Полностью неметилированный ген транскрибировался, тогда как полностью метилированный ген (метильная группа на каждом подходящем остатке Ц) не транскрибировался. С использованием частично метилированных клонов было показано, что метилирование в 5’-области глобинового гена (нуклеотиды от –760 до +100) предотвращает транскрипцию. Таким образом, метилирова-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

156 _______________ ГЛАВА 12 _______________________________________________________________________

Рис. 12.19. Схема метилирования глобиновых генов. А. Метилирование ß -цепей глобина кролика (ß 1, ß 2, ß 3, ß 4). Каждый ген этого кластера представлен серым квадратом. Последовательности ЦЦГГ обозначены кружками, причем черными кружками обозначены те из них, которые полностью метилированы только в клетках, не транскрибирующих глобины. Б. Метилирование контролирует транскрипцию клонированного гена фетального γ -глобина человека. На верхней диаграмме показаны клонированный глобиновый ген и его 5'- и 3'-фланкирующие области. Экзоны обозначены черным цветом, интроны – белым, фланкирующие области – тонкими линиями. Под диаграммой представлена карта возможных сайтов метилирования ДНК, которые представляют собой участки, где присутствует динуклеотид ЦфГ. Под этой картой приведены схемы метилирования пяти клонов, которые были изучены в данной работе. Прямыми линиями изображены неметилированные сегменты, волнистыми – метилированные. Знаки + и – с правой стороны рисунка указывают на то, экспрессировались или не экспрессировались данные сегменты. (А – по Shen, Maniatis, 1980; Б – по Busslinger et al., 1983.)

ние на 5’-конце гена играет, по-видимому, главную роль в регуляции экспрессии генов.

Третья группа данных получена в экспериментах, в которых изначально неактивные гены активировались при их деметилировании непосредственно внутри ядер. Была получена корреляция между активацией молчащих генов и утратой метильных групп из их цитозинов. Из гл. 10 мы узнали, что неактивные гены, специфичные для печени, могут быть активированы в фибробластах мыши после слияния этих фибробластов с клетками печени. Эта активация сопровождается деметилированием генов, специфических для печени особенно в их 5'-областях (Sellem et al., 1985). Когда 5'-области этих генов деметилированы, они похожи на активные гены, специфические для печени, и активно транскрибируют РНК.

Другой метод деметилирования генов заключается в обработке клеток препаратом 5-азацитидином. Полагают, что это соединение ингибирует метилтрансферазу, что приводит к деметилированию той ДНК, которая обычно является метилированной (Razin et al., 1984). Когда 5-азацитидин добавляли к колониям мышиных фибробластов С3Н10Τ 1/2, эти клетки с высокой частотой превращались в миоциты, адипоциты или хондроциты (Taylor, Jones, 1982; Konieczny, Emerson, 1984). Полученные фенотипы были стабильны, на основании чего можно предположить, что характер метилирования передается через многие циклы клеточных делений. Было показано, что ДНК из миобластов, полученных из обработанных 5-азацитидином клеток C3H10T1/2, способна превращать другие клетки C3H10T1/2в миобласты, тогда как ДНК из необработанных клеток С3Н10Т1/2 не обладает этой способностью (Lassar et al., 1986).

Четвертая группа данных, свидетельствующих о регуляции транскрипции с помощью метилирования ДНК, получена в исследованиях инактивации Х-хромосомы у млекопитающих. В этом случае метилирование ДНК играет главную роль в поддержании неактивного состояния одной из двух Х-хромосом в каждой клетке. Предположение о существовании определенных различий в ДНК хромосом впервые возникло на основе данных, полученных в опытах по трансфекции гена гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (ГФРТ), связанного с Х-хромосомой, в мышиные клетки фенотипа ГФРТ^– (Liskay, Evans, 1980). Когда использовали клон клеток, в которых ген находился на неактивной Х-хромосоме, получен-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________ МЕХАНИЗМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ _________________________ 157

ная ДНК была неспособна вызвать синтез фермента в клетке-хозяине ГФРТ^–. Когда ДНК получали из клона клеток, имеющих ген ГФРТ на активной Х-хромосоме, в трансформированных клетках фермент синтезировался.

Годом позже было получено еще одно подтверждение того, что метилирование играет в инактивации Х-хромосомы определенную роль: тогда было обнаружено, что 5-азацитидин локально реактивирует гены на неактивной Х-хромосоме. Группа исследователей сконструировала гибридные клетки, в которых были активная Х-хромосома мыши и неактивная Х-хромосома человека (Mohandas et al., 1981). После обработки 5-азацитидином были обнаружены клоны клеток, которые синтезировали фермент ГФРТ с Х-хромосомы человека.

И наконец, оказалось, что некоторые конститутивные ферменты, кодируемые Х-хромосомой (т. е. те ферменты, которые должны присутствовать в каждой клетке, а не только в специализированных), имеют на 5’-концах своих генов кластеры из ЦГ-богатых участков. В активной Х-хромосоме по крайней мере у трех генов 5'-кластеры гипометилированы, тогда как эти же кластеры в аналогичных генах на неактивной Х-хромосоме интенсивно метилированы (Wolf et al., 1982; 1984; Keith et al., 1986). Сходным образом группы ЦфГ на 3'-концах генов более метилированы в неактивной Х-хромосоме. чем в активной. Когда Х-хромосома реактивируется (естественным образом, как в ворсинках хориона или в опыте с 5-азацитидином). эти кластеры становятся гипометилированными ¹ (Wolf et al., 1984). Помимо этого, когда клетки тератокарциномы дифференцируются и одна из Х-хромосом инактивируется. ЦфГ-кластеры на этих генах становятся метилированными (Lock et al., 1987). Хотя инициатор инактивации Х-хромосомы до сих пор неизвестен, весьма вероятно, что метилирование ДНК поддерживает неактивное состояние Х-хромо-

¹ Б о льшая часть изученных к настоящему времени генов, зависимых от РНК-полимеразы II, являются генами, продукты которых (например, гемоглобин, овальбумин и коллаген) характеризуют клетку определенного типа. Это вызвано тем, что такие гены производят необычно большое количество конкретных мРНК, которые могутбыть легко изолированы и затем использованы как зонды для клонированных генов. Эти гены регулируются в развитии так, что их экспрессия происходит в специфических типах клеток в определенные периоды времени. Те гены, которые не регулируются в развитии (их продукты присутствуют в большинстве клеток на всех стадиях), могут контролироваться другим образом и иметь другую структуру. Для таких генов не нужны последовательности ТАТА или ЦААТ (Mellon et al., 1986; Reynolds et al., 1984). Они, по-видимому, должны иметь кластеры ЦфГ вблизи 5’-концов. Эти кластеры обычно гипометилированы и находятся в участках, гиперчувствительных к ДНКазе I (Wolf, Migeon, 1984)

Рис. 12.20. Мидель передачи характера метилирования дочерним молекулам. В ходе репликации исходный тип метилирования сохраняется лишь в одной из двух цепей ДНК (в «старой»). Другая цепь («новая») не метилирована. Фермент метилирования, специфичный к ЦГ. может присоединяться к тем ЦГ-парам. где остаток Ц метилирован, и затем метилировать остаток Ц на комплементарной цепи. (По Browder. 1984.)

сомы и передает его от одного поколения клеток к другому (Kaslow, Migeon, 1987).

Если предложенная гипотеза о деметилировании справедлива, то распределение метилированных и деметилированных цитозинов должно устойчиво наследоваться на протяжении многих клеточных делений и «стираться» в половых клетках. Так в действительности и происходит. Установленный в клетках специфический характер метилирования стабилен на протяжении более 100 клеточных делений (Wigler et al., 1981; Stein et al., 1982). Предложен механизм для передачи этого распределения (Stein et al., 1982). Когда исследователи трансфицировали клетку гемиметилированной ДНК (т.е. ДНК. в которой только одна цепь метилирована), то метилирование ЦГ было обнаружено у всего клонального потомства этой клетки после многих клеточных делений. Предположили, что ЦГ-специфический метилирующий фермент использует метилированные цитидины как матрицу для метилирования цитидинов на компле-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

158 _______________ ГЛАВА 12 __________________________________________________________

ментарной цепи (рис. 12.20). Это объясняет также, почему за метилированными цитидинами всегда следуют гуанозины.

В развивающихся спермиях не наблюдается ни одно из распределений гипометилирования, характерных для соматических клеток. Все специфические для клеток гены (глобинов, овальбумина, иммуноглобулинов и т.д.) являются высокометилированными. Большая часть гипометилированных сайтов, обнаруженных до сих пор в сперматозоидах (предшественниках спермиев), оказываются метилированными в зрелых спермиях. По разнице в метилировании генов спермия и яйца можно определить, получен ли ген от отца или от матери. Если ядра первичных половых клеток и у самцов, и у самок резко гипометилированы (Monk et al., 1987), то гены спермия и яйца интенсивно метилированы. Кроме того, характер метилирования данного гена в яйце и спермии может различаться (Reik et al., 1987; Sapienza et al., 1987). Этот материнский и отцовский импринтинг добавляет информацию к наследуемым геномам – информацию, которая может регулировать активность генов и поведение хромосом в пространстве и во времени. В эксперименте была получена линия трансгенных мышей, у которых в геном был встроен ген, индуцирующий образование опухоли (этот процесс будет рассмотрен в гл. 20) (Swain et al., 1987). Если этот ген был унаследован от самца, то он транскрибировался исключительно в сердце, но ни в какой другой ткани. В случае если этот ген наследовался от самки, он не экспрессировался вовсе. Этот характер экспрессии коррелировал со степенью метилирования. Рассматриваемый ген метилировался в ходе созревания яйца и деметилировался при образовании спермия. Такая специфичная для гамет разница в метилировании дает правдоподобное объяснение неспособности к развитию партеногенетических млекопитающих и необходимости присутствия в зиготе обоих пронуклеусов отцовского и материнского.

Очевидно, что метилирование является важным механизмом регуляции активности генов, но оно не может применяться для всех генов. По-видимому, этот процесс широко распространен среди позвоночных, но даже у них некоторые гены сохраняют способность к транскрипции, хотя и являются метилированными (Gerber-Huber et al., 1983). Кроме того, метилирования ДНК не происходит, очевидно, у дрозофилы, где тканеспецифическая транскрипция генов хорошо документирована.

Дополнительные сведения и гипотезы: Определение сайтов метилирования

Когда происходит метилирование ДНК, оно практически всегда идет по цитидину из ЦфГ-пары. Распределение этих метилированных и неметилированных ЦГ-дуплетов определяется с помощью разрезания ДНК двумя рестриктазами. Hpa IIи Msp I(McGhee, Ginder, 1979). Оба этих фермента разрезают в одном сайте, ЦЦГГ, но Нра IIне будет разрезать ДНК, если метилирован центральный Ц, тогда как Msp Iбудет разрезать эту последовательность независимо от того, метилирована она или нет. Следовательно, ДНК из клеток определенного типа может быть гидролизована Hpa IIи отдельно Msp I; затем фрагменты расщепленной ДНК могут быть разделены с помощью электрофореза в геле, перенесены на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизованы с радиоактивным зондом, специфичным для исследуемого гена. Разницу в распределении зон на радиоавтографах для фрагментов, полученных с Msp Iи с Hpa II, можно объяснить разницей в метилировании.

На рис. 12.21 показан результат одного из экспериментов с выделением ДНК спермиев и ее обработкой Hpa IIи Msp I. Зондом являлась радиоактивная ДНК из второго экзона ß -глобинового гена. Радиоавтограф фрагментов Msp I-гидролизата

Рис. 12.21. Обнаружение сайтов метилирования в ДНК. ДНК выделяли из спермы петуха и гидролизовали рестриктазой Msp I(дорожка 1) или Hpa II (дорожка 2). Фрагменты разделяли с помощью электрофореза, переносили на фильтр и гибридизовали с радиоактивным ДНК-зондом из второго экзона ß -глобинового гена. Этот зонд связывался с фрагментом длиной 1400 нуклеотидов в Msp I - гидролизате и с фрагментом длиной примерно 25 000 нуклеотидов в Hpa II-гидролизате. (Из Groudine, Conklin, 1985; фотография с любезного разрешения M. Groudine.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________ МЕХАНИЗМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ ___________________________ 159

показывает, что этот зонд присоединяется к фрагментам ДНК, у которой ЦЦГГ-сайты лежат друг от друга на расстоянии 1400 пар оснований. Радиоавтограф с Hpa II-гидролизатом показывает, что в ДНК спермиев эти сайты метилированы и что исследуемая последовательность ДНК лежит на отрезке ДНК длиной 25 000 пар оснований, на котором все ЦЦГГ-сайты метилированы (Groudine, Conklin, 1985).