Инактивация белков при посттрансляционных модификациях

Изменения предсуществующих белков могут приводить также к их инактивации. Ранее в этой главе мы указали, как фосфорилирование инактивирует фактор инициации 2, регулируя тем самым синтез гемоглобина. Сходным образом инактивируются при фосфорилировании гликоген-синтетаза и пируваткиназа. Глутамин-синтетаза инактивируется, когда на нее переносится остаток АМФ. Поскольку все эти реакции обратимы, каталитическая активность белков может регулироваться исключительно точно с помощью изменения активности ферментов, добавляющих или отщепляющих модифицирующие группы.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

222 _______________ ГЛАВА 14 _____________________________________________________________________________

В ряде случаев некоторые белки опасно оставлять внутри клетки. Например, необходимо, чтобы быстро разрушались белки, вызывающие переход клеток к делению, если с ростом клеток скоординирован синтез ДНК. Эти быстро разрушающиеся белки (время полужизни которых составляет менее 2 ч) содержат одну или несколько областей, богатых пролином, глутаминовой кислотой, серином и треонином (Rogers et al., 1986). Долгоживущие белки редко имеют такие кластеры, а если и имеют, то они упрятаны глубоко внутри структуры белка. Однако наиболее важным единичным детерминантом времени жизни белка является, по-видимому, его аминоконцевая аминокислота. Бахмайр и др. (Bachmair et al., 1986) с помощью мутирования клонированного гена для ß -галактозидазы изменяли первый кодон (АУГ) на кодоны для пятнадцати других аминокислот. Когда клетки дрожжей были трансформированы этими шестнадцатью плазмидами, несущими ген дикого типа или один из его мутантных аллелей, разница в продолжительности жизни соответствующего белка оказалась огромной (табл. 14.6). И если время полужизни внутри клетки для нормальной ß -галактозидазы (с метионином на своем аминоконце) составляет более 20 ч, то в случае других аминоконцевых аминокислот это время порой сокращается до менее 3 мин.

Таблица 14.6. Зависимость стабильности белка от концевого аминокислотного остатка
Остаток Х в X-ß -галактозидазе	Время полужизни X-ß -галактозидазы
Источник: Bachmair et al., 1986.

Корреляция между продолжительностью жизни белка и его аминоконцевой аминокислотой распространяется, очевидно, также и на природные белки. Кроме того, эта корреляция соответствует наблюдениям, что аминоконцы белков претерпевают посттрансляционную модификацию при гибели клеток in vivo (Softer, 1980, Shyne-Athwal et al., 1986). При этом на аминоконцы белков переносятся с аминоацилированных тРНК дестабилизирующие аминокислоты (Apг, Лиз, Лей, Фен и Тир). Предполагается, что определенный фактор присоединяется к другим клеточным белкам, превращая их в мишень для деградации, и что вероятность связывания этого фактора с любым данным белком зависит от его аминоконца (Bachmair et al., 1986). Связавшись, этот фактор обеспечивает присоединение к данному белку убиквитина. Пришивание убиквитина (небольшой пептид, который образует ковалентные связи с остатками лизина белка-мишени) маркирует белок для деградации. На рис. 14.27 показано, что каждая молекула ß -галактозидазы, намеченная для деградации, комплексируется с молекулами убиквитина в количестве до 15.

Клетки различаются по белкам, которые они способны разрушать. Один из таких примеров лактатдегидрогеназа (ЛДГ), которая катализирует обратимое взаимопревращение пирувата и лактата. ЛДГ кодируется двумя различными генами: один ген кодирует субъединицы ЛДГ-А, а другой ЛДГ-В. Эти гены находятся на разных хромосомах. Функциональный фермент ЛДГ является тетрамером. т.е. он состоит из четырех субъединиц. Эти субъединицы могут быть А- или В-разновидностей. Если экспрессируются оба гена, то ожидается присутствие пяти различных форм ЛДГ: A4, А3В1, А2В2, А1В3 и В4. Альтернативные формы фермента называют изоферментами. Эти изоферменты ЛДГ обладают различной каталитической активностью при различных клеточных условиях. Если оба гена ЛДГ экспрессируются одинаково и рекомбинация субъединиц происходит случайно, то можно ожидать появления изоферментов разных типов в следующем отношении 1(А4): 4(А3В1): 6(А2В2): 4(А1В3): 1(В4). Эти изоферменты имеют различные электрические заряды, так как субъединица В несет больший отрицательный заряд, чем субъединица А. Следовательно, эти пять изоферментов можно разделить при электрофорезе и затем окрасить их на каталитическую активность (рис. 14.28). Когда равные количества субъединиц объединяются искусственно, действительно обнаруживается отношение 1: 4: 6: 4: 1. Однако если обратиться к индивидуальным органам, то наблюдаются значительные отклонения от этого соотношения. Мышечная ЛДГ состоит преимущественно из А-субъединиц, тогда как изоферменты в семенниках, сердце и поч-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

Рис. 14.27. Разрушение ß -галактозидазы с различными аминокислотами на аминоконце. Плазмиды, несущие различные гены (каждая плазмида содержала один ген ß -галактозидазы, но каждый ген кодировал различные аминоконцы), вводили в клетки дрожжей, которые затем метили радиоактивным метионином в течение 5 мин. Клетки лизировали и ген Р-галактозидазы выделяли с помощью иммунопреципитации антителами, полученными к этому ферменту. Белки, узнаваемые антителами (и поэтому выпадающие в осадок), отделяли от антител и неосажденных белков, разделяли в геле и подвергали радиоавтографии. Те полипептиды β -галактозидазы, которые начинались метионином (Мет) или валином (Вал), разрушались в очень незначительной степени. Полипептиды, начинавшиеся изолейцином (Иле), тирозином (Тир) или глутамином (Глн), разрушались достаточно сильно (накопление молекул в нижней части геля), присоединяя наряду с этим несколько пептидов убиквитина (набор полос в верхней части геля свидетельствует об утяжелении интактного белка). ß -Галактозидазы, начинающиеся лейцином (Лей) или аргинином (Apг), разрушались в еще большей степени. (Из Bachmair et al., 1986; фотография с любезного разрешения A.Bachmair.)

Рис. 14.28. Гель-электрофорез, показывающий различное содержание пяти изоферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в разных тканях крысы. (Из Markert, Ursprung, 1971.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

224 _______________ ГЛАВА 14 _____________________________________________________________________________

ках составлены в основном из В-субъединиц (Markert, 1968).

Используя антитела к ЛДГ для осаждения новосинтезированных А-субъединиц, группа исследователей (Fritz et al., 1969) показала, что скорость синтеза ЛДГ-А существенно не варьирует в разных тканях. Однако скорость ее разрушения варьирует очень сильно. ЛДГ-А сердечной мышцы разрушается в 22 раза быстрее, чем в скелетной мышце. Поэтому контроль изоферментов ЛДГ осуществляется не на уровнях транскрипции или трансляции, а на уровне разрушения фермента.

Субклеточная компартментализация белков с помощью посттрансляционных модификаций: адресование белков в мембраны и лизосомы

После того как белки синтезированы, они должны быть правильно размещены в клетке. В конечном итоге белок может быть локализован в растворимой цитоплазме, митохондриях, лизосомах, эндоплазматическом ретикулуме или ядре: он может быть даже выделен клеткой.

Белки, которые предназначены для лизосом, эндоплазматического ретикулума или секреции, проходят в полость гранулярного эндоплазматического ретикулума в то время, когда они еще транслируются (рис. 14.29). Эти белки (включая коллаген и пептидные гормоны, обсуждавшиеся ранее) имеют сигнальную последовательность, состоящую примерно из 30 аминокислот, которая узнается сигнальным рецепторным комплексом, плавающим в цитоплазме. Когда этот комплекс (который содержит шесть различных пептидных цепей и небольшую молекулу РНК) связывается с пептидом, растущим на цитоплазматической рибосоме, трансляция останавливается. Затем этот комплекс присоединяется к якорному белку на эндоплазматическом ретикулуме, и трансляция возобновляется. Растущие полипептиды проходят через мембрану ретикулума, и, когда они оказываются внутри полости, сигнальная последовательность удаляется, а остающийся белок может быть модифицирован (Blobel, Dobberstein, 1975; Walter, Blobel, 1983; Weidmann et al., 1987). Если белок (или предшественник белка) содержит гидрофобную область, то он, возможно, станет частью эндоплазматического ретикулума, а позже клеточной мембраны. Одна из нерешенных проблем в этой области касается того, как белки локализуются в конкретных участках клеточной мембраны. Так, в плазматических мембранах клеток многих типов определенные белки находятся только на одной стороне мембраны. Мы наблюдали подобное явление при поляризации бластомеров млекопитающих перед компактизацией. Недавно полученные данные (Mostov, 1987) свидетельствуют о том, что существуют определен-

Рис. 14.29. Модели трансляции и гликозилирования секретируемых белков. Первые примерно 50 аминокислот полипептида обычно кодируют «сигнальную последовательность», которая указывает, что данный белок предназначен для встраивания в мембраны гранулярного эндоплазматического ретикулума (ГЭР). Эта последовательность узнается сигнальным рецепторным комплексом и затем сайтами на ГЭР. Когда она оказывается внутри полости, часть этой последовательности отрезается. При дальнейшей элонгации белка к нему добавляются углеводы.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ТРАНСЛЯЦИОННАЯ И ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ РАЗВИТИЯ ____________________ 225

ные последовательности аминокислот, которые специфичны для апикального и базального участков клеточной мембраны.

Одной из таких модификаций является ковалентное присоединение к белку маннозо-6-фосфата. Этот сахар играет роль адресной метки, по которой собираются гликопротеиды для лизосом. Маннозо-6-фосфат узнается рецепторами в определенных областях эндоплазматического ретикулума, благодаря чему там концентрируются ферменты, имеющие эту адресную метку. Затем эта область ретикулума отпочковывается и образует лизосому (Sly et al., 1981). Если модификация не происходит, то эти белки выделяются из клетки. Доказательством этого служит летальный генетический синдром. I-клеточная болезнь, при которой у больных нарушена способность присоединять к белкам адресную метку из маннозо-6-фосфата. У этих больных в лизосомах отсутствуют соответствующие ферменты, которые ошибочно выделяются в кровь.

Для некоторых белков имеются специфичные связывающие полипептиды, которые локализуют эти белки в определенных областях клетки. В печени мыши ß -глюкуронидаза находится и в лизосомах, и на эндоплазматическом ретикулуме. Метка маннозо-6-фосфата может направить этот фермент в лизосомы, однако в печени ß -глюкуронидаза может быть присоединена к эндоплазматическому ретикулуму с помощью белка игазина (Swank, Paigen, 1973), который специфически узнает этот фермент. На эндоплазматическом ретикулуме клеток печени у мутантной мыши, лишенной игазина, ß -глюкуронидаза не обнаруживается (Lusis et al., 1976). Локализация ß -глюкуронидазы в клетках разных типов обычно различается. Такие ткани, как печень и почки, богаты игазином и имеют ß -глюкуронидазу на эндоплазматическом ретикулуме. Напротив, клетки мозга и селезенки, по-видимому, полностью лишены игазина и содержат всю ß -глюкуронидазу в лизосомах (Lusis, Paigen, 1977). Таким образом, внутриклеточная локализация белков регулируется посттрансляционно и может быть различна в разных тканях.