Показатели доброкачественности.

Допустимые примеси (#2.8.2). Не сырьевые части растения: остатки цветоносов, в том числе отделенные от корзинок при анализе, — не более 6 %; корзинки с полностью осыпавшимися язычковыми и трубчатыми цветками (цветоложе с обвертками) — не более 20%; побуревшие корзинки — не более 3% [8, 12, 11, 9], не более 7% [3]; другие части растения (кусочки стеблей и листьев) — не более 3 %[8, 2, 11], не более 10 %[9]. Остатков прицветников не более 5 %, других посторонних примесей не более 2 % [1, 2, 10, 11]. Экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом 70 %, не менее 35 % [9, 12]; экстрактивных веществ, извлекаемых водой, не менее 35 % [9]. Частиц, проходящих сквозь сито с размером отверстия 1, 0 мм, не более 2 % [3]. Органические примеси: не более 0, 5 % [8, 12, 9], не более 1, 5% [3]. Минеральные примеси: не более 0, 5 % [8, 12, 9], не более 0, 3 % [3].

Потеря в массе при высушивании (2.2.32). Не более 14, 0 %. 2, 000 г измельченного сырья (2000) сушат при температуре от 100°С до 105°С [8, 9, 12]. Не более 12%. 1.000 г измельченного в порошок сырья (500) (2.9.12) сушат при температуре 105 °С в течении 2 ч [1, 2, 3, 10, 11].

Общая зола (2.4.16). Не более 11, 0 % [8, 9, 12], не более 10 %[1, 2, 10, 11, 3].

Зола, нерастворимая в хлористоводородной кислоте (2.8.1). Не более 5, 0% [8].

В гомеопатической Фармакопее Франции и Германии показатели доброкачественности приведены для гомеопатической настойки календулы.

Плотность: 0, 970-0, 980 [4]. Содержание этанола (V.5.3.A). Содержание этанола составляет от 50 % V / V до 60 % V / V [6].

Сухого остатка: не менее 0, 4 % [4], не менее 0, 75 % [6].

В Фармакопее РФ и Польши также приведен допустимый предел содержания в сырье частиц, проходящих сквозь сито с определенным размером отверстий (таблица 6.2.1) [9, 3].

Таблица 6.2.1 – Допустимый предел содержания частиц, проходящих сквозь сито с определенным размером отверстий

6.3 Методы определения действующих веществ [1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11]

6.3.1 Качественный анализ

1.Тонкослойная хроматография (2.2.27) [1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11].

Испытуемый раствор. К 1, 0 г измельченного сырья (500) прибавляют 10 мл метанола Р и нагревают на водяной бане с обратным холодильником в течение 10 мин. Охлаждают и фильтруют.

Раствор сравнения. 1, 0 мг кислоты кофейной Р, 1, 0 мг кислоты хлорогеновой Р и 2, 5 мг рутина Р растворяют в 10 мл метанола Р.

Пластинка: ТСХ пластинка со слоем подходящего силикагеля.

Подвижная фаза: кислота муравьиная безводная Р — вода Р — этилацетат Р (10: 10: 80, об/об/об).

Наносимый объем пробы: 20 мкл испытуемого раствора и 10 мкл раствора сравнения в виде полос.

Фронт подвижной фазы: не менее 10 см от линии старта.

Высушивание: при температуре от 100°С до 105°С.

Проявление: горячую пластинку опрыскивают раствором 10 г/л дифенилборной кислоты аминоэтилового эфира Р в метаноле Р и затем раствором 50 г/л макрогола 400 Р в метаноле Р. Пластинку высушивают на воздухе в течение 30 мин и просматривают в ультрафиолетовом свете при длине волны 365 нм.

Результаты: на хроматограмме раствора сравнения обнаруживаются: в нижней части флуоресцирующая зона желтовато-коричневого цвета (рутин), в средней части светлая флуоресцирующая зона синеватого цвета (хлорогеновая кислота) и в верхней части светлая флуоресцирующая зона синего цвета (кофейная кислота). На хроматограмме испытуемого раствора обнаруживаются: флуоресцирующая зона желтовато-коричневого цвета, соответствующая рутину на хроматограмме раствора сравнения, ниже нее флуоресцирующая зона желтовато-зеленого цвета и непосредственно над ней флуоресцирующая зона светло-синего цвета, соответствующая хлорогеновой кислоте на хроматограмме раствора сравнения, флуоресцирующая зона желтовато-зеленого цвета над ней и флуоресцирующая зона светло-синего цвета немного ниже зоны, соответствующей кофейной кислоте на хроматограмме раствора сравнения. На хроматограмме испытуемого раствора могут обнаруживаться и другие флуоресцирующие зоны.

Примечание 1 -- приготовление дифенилборной кислоты β -этиламинового эфира раствора 1%. 0, 1 г дифенилборной кислоты β -этиламинового эфира растворяют в 10 мл спирта 96 %. Раствор используют свежеприготовленным.

Примечание2 -- приготовление полиэтиленгликоля 400 раствора 5 %. 0, 5 г полиэтиленгликоля 400 растворяют в 10 мл спирта 96 %, слегка подогревая раствор на водяной бане. Раствор используют свежеприготовленным.

Примечание3 -- приготовление стандартного раствора. 1 мг кофейной кислоты, 1 мг хлорогеновой кислоты и 2, 5 мг рутина растворяют в 8 мл спирта 96 % в мерной колбе вместимостью 10 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки. Раствор используют свежеприготовленным.

2.Тонкослойная хроматография (2.2.27).

Испытуемый раствор. 1 г измельченного сырья (1000) помещают в колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 10 мл спирта (50 %, об/об) Р и кипятят с обратным холодильником в водяной бане в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Охлаждают и фильтруют.

Раствор сравнения. 5 мг рутина Р растворяют в 10 мл 96 % спирта Р.

Пластинка: ТСХ пластинка со слоем подходящего силикагеля.

Подвижная фаза: бутанол Р — кислота уксусная ледяная Р — вода Р (4: 1: 2, об/об/об).

Наносимый объем пробы: по 10 мкл в виде полос.

Фронт подвижной фазы: не менее 10 см от линии старта.

Высушивание: на воздухе.

Проявление: пластинку опрыскивают раствором 20 г/л алюминия хлорида Р в 96 % спирте Р, нагревают в сушильном шкафу в течение 2—3 мин при температуре от 100°С до 105°С и просматривают в ультрафиолетовом свете при длине волны 365 нм.

Результаты: На хроматограмме испытуемого раствора обнаруживаются флуоресцирующая зона ярко-желтого цвета на уровне зоны такого же цвета на хроматограмме раствора сравнения, не менее двух других флуоресцирующих зон ярко-желтого цвета и двух зон голубого цвета. На хроматограмме испытуемого раствора могут обнаруживаться и другие зоны [8].

3. Около 1 г измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 50 мл, приливают 10 мл хлороформа, кипятят с обратным холодильником в течение 10 мин и охлаждают. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр и выпаривают на кипящей водяной бане до объема 1 мл (раствор Б).

На линию старта хроматографической пластинки со слоем силикагеля размером 10× 15 см наносят 30 мкл испытуемого раствора Б и 20 мкл раствора СО β -каротина. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе в течение 5 мин, помещают в хроматографическую камеру со смесью растворителей гексан-бензол (85: 15) и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет расстояние 10 см от линии старта, пластинку вынимают из камеры и сушат на воздухе до удаления следов растворителей в течение 10-15 мин.

На хроматограмме испытуемого раствора Б должна обнаруживаться основная зона на уровне зоны на хроматограмме раствора СО β -каротина. Допускается наличие 2 дополнительных зон желто-оранжевого цвета ниже зоны β -каротина и зона на старте.

Примечание 4 -- приготовление раствора стандартного образца β -каротина. 0, 02 г β -каротина растворяют в хлороформе в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора хлороформом до метки и перемешивают.

1 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора хлороформом до метки, перемешивают. Раствор должен быть свежеприготовленным.

4. Около 5 г измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 100 мл, приливают 50 мл спирта 70 %. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и кипятят на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр (раствор А).

К 1 мл раствора А прибавляют 0, 2 мл 3 % раствора железа (III) хлорида, должно наблюдаться образование окрашивания зеленовато-коричневого цвета, исчезающее при добавлении кислоты серной разведенной (дубильные вещества).

К 2 мл раствора А приливают 1 мл воды, по стенке осторожно приливают 1 мл раствора ванилина в кислоте серной, на границе слоев должно наблюдаться образование окрашивания красновато-коричневого цвета в виде кольца (тритерпеновые соединения) [9].

Качественное определение по Фармакопее Франции [6]:

1. Добавить к 1 мл базовой настойки 10 мл воды. Встряхивать. Это образует обильную пену.

2. Добавить к 1 мл настойки 5 мл эфира Р и немного активированного угля Р. Встряхнуть и процедить. Берут 2 мл фильтрата и упаривают его в водяной бане. К остатку добавляют 1 мл смеси равных объемов уксусного ангидрида R, хлороформа и 1 мл серной кислоты A. Наблюдается переход от красного до коричневого цвета.

6.3.2 Количественный анализ

Определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид [8, 1, 2, 10, 11]. 0, 800 г измельченного сырья (500) помещают в круглодонную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 1 мл раствора 5 г/л гексаметилентетрамина Р, 20 мл ацетона Р и 7 мл кислоты хлористоводородной Р1. Кипятят с обратным холодильником в течение 30 мин, после чего извлечение процеживают через ватный тампон в колбу. Ватный тампон помещают в круглодонную колбу с остатком сырья и дважды кипятят с обратным холодильником в течение 10 мин, каждый раз прибавляя 20 мл ацетона Р в качестве экстрагента. Охлаждают и процеживают через ватный тампон. Объединенные ацетоновые извлечения фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, ополаскивают круглодонную колбу ацетоном Р и фильтруют через тот же фильтр, после чего фильтр промывают ацетоном Р. Объем раствора доводят до 100, 0 мл ацетоном Р. 20, 0 мл полученного раствора помещают в делительную воронку, прибавляют 20 мл воды Р и экстрагируют этилацетатом Р порцией 15 мл, затем еще трижды порциями по 10 мл. Этилацетатные извлечения объединяют, помещают в делительную воронку и дважды промывают водой Р порциями по 50 мл. Органический слой фильтруют через бумажный фильтр с 10 г натрия сульфата безводного Р в мерную колбу, вместимостью 50 мл и доводят этилацетатом Р до объема 50, 0 мл (раствор А).

Испытуемый раствор. К 10, 0 мл раствора А прибавляют 1 мл реактива алюминия хлорида Р и доводят 5 % (об/об) раствором кислоты уксусной ледяной Р в метаноле Р до объема 25, 0 мл.

Компенсационный раствор. 10, 0 мл раствора А доводят 5 % (об/об) раствором кислоты уксусной ледяной Р в метаноле Р до объема 25, 0 мл.

Через 30 мин измеряют оптическую плотность (2.2.25) испытуемого раствора при 425 нм.

Содержание флавоноидов в пересчете на гиперозид в процентах рассчитывают по формуле (6.3.2.1):

(6.3.2.1)

где

500 — удельный показатель поглощения гиперозида;

А — оптическая плотность испытуемого раствора;

m — масса навески испытуемого сырья, г.

Определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин [8]. 1, 000 г измельченного сырья (710) помещают в колбу вместимостью 150 мл, прибавляют 30 мл спирта (50 %, об/об) Р. и нагревают с обратным холодильником в водяной бане в течение 30 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Горячее извлечение процеживают через ватный тампон в мерную колбу вместимостью 100 мл так, чтобы частицы сырья не попадали на фильтр. Ватный тампон помещают в колбу с остатком сырья и прибавляют 30 мл спирта (50 %, об/об) Р. Экстракцию повторяют еще дважды в описанных выше условиях, процеживая извлечение в ту же мерную колбу. Охлаждают и доводят спиртом (50 %, об/об) Р до объема 100, 0 мл (раствор А).

Испытуемый раствор. К 1, 0 мл раствора А прибавляют 10 мл спирта (70 %, об/об) Р и 2, 0 мл раствора 50 г/л алюминия хлорида Р в спирте (70 %, об/об) Р. Через 10 мин прибавляют 2, 0 мл 5 % (об/об) раствора кислоты уксусной Р в спирте (70 %, об/об) Р и доводят спиртом (70 %, об/об) Р до объема 25, 0 мл.

Компенсационный раствор. К 1, 0 мл раствора А прибавляют 10 мл спирта (70 %, об/об) Р и 2, 0 мл 5 % (об/об) раствора кислоты уксусной Р в спирте (70 %, об/об) Р и доводят спиртом (70 %, об/об) Р до объема 25, 0 мл.

Через 1 ч измеряют оптическую плотность (2.2.25) испытуемого раствора при 408 нм.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в процентах рассчитывают по формуле (6.3.2.2):

(6.3.2.2)

где

220 — удельный показатель поглощения комплекса рутина с алюминия хлоридом;

А — оптическая плотность испытуемого раствора;

m — масса навески испытуемого сырья, г.

Количественное определение по ГФ РФ [9]:

1. Около 1 г (точная навеска) измельченных цветков ноготков, просеянных сквозь сито с отверстиями размером 1 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 50 мл спирта 70 %, колбу закрывают пробкой, взвешивают (с погрешностью ± 0, 01 г) и оставляют на 1 ч. Затем колбу соединяют с обратным холодильником, нагревают, поддерживая слабое кипение в течение 2 ч. После охлаждения колбу с содержимым вновь закрывают той же пробкой, взвешивают и потерю в массе восполняют растворителем. Содержимое колбы тщательно взбалтывают и фильтруют через сухой бумажный фильтр, отбрасывая первые 20 мл, в сухую колбу вместимостью 200 мл (раствор А).

1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл раствора алюминия хлорида, 0, 1 мл кислоты уксусной и доводят объем раствора спиртом 96 % до метки и оставляют на 40 минут (раствор Б).

Через 40 минут измеряют оптическую плотность испытуемого раствора Б и раствора стандартного образца Б1 на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны (408 + 2) нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя растворы сравнения для испытуемого раствора и стандартного образцов.

Содержание суммы флавоноидов в процентах (Х) в пересчете на рутин вычисляется по формуле (6.3.2.3):

(6.3.2.3)

где

А - оптическая плотность испытуемого раствора;

Ао- оптическая плотность раствора стандартного образца рутина;

а - навеска сырья, г;

ао- навеска стандартного образца рутина, г;

W - влажность сырья, %;

Допускается проводить определение содержания суммы флавоноидов с использованием удельного показателя поглощения рутина.

Примечание 5 -- приготовление спирта 70 %. 70 мл спирта помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

Примечание 6 -- спирт 96 %. Этанол 96 %. Спирт этиловый 96% очищенный.

Примечание 7 -- приготовление алюминия хлорида раствора. 65, 0 г алюминия хлорида растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до 100 мл. Прибавляют 0, 5 г угля активированного, перемешивают в течение 10 мин и фильтруют. К фильтрату при непрерывном перемешивании прибавляют достаточное количество 1 % раствора натрия гидроксида (около 60 мл) до получения рН около 1, 5.

Примечание 8 -- приготовление раствора сравнения для стандартного раствора. К 1, 0 мл стандартного раствора А1 прибавляют 0, 1 мл уксусной кислоты раствора, доводят спиртом 96 % до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл и перемешивают (раствор сравнения готовится параллельно с раствором Б1).

Примечание 9 -- приготовление раствора сравнения для испытуемого раствора Б. К 1 мл раствора А прибавляют 0, 1 мл кислоты уксусной и доводят спиртом 96 % до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл и перемешивают (раствор сравнения готовится параллельно с раствором Б).

Примечание 10 -- приготовление раствора СО рутина. Около 0, 05 г (точная навеска) рутина предварительно высушенного при 130-135 °С в течение 3 ч, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворяют при нагревании на кипящей водяной бане в 85 мл спирта 96 %, охлаждают, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают (раствор А1).

2. Экстрактивные вещества, извлекаемые водой. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье». Экстрагент - вода очищенная, спирт этиловый 70%.