Подготовка и проведение исследования

2.11.4.1. Приготовление растворов

Десятикратные концентраты элюирующих растворов готовят на стерильной дистиллированной воде.

1) Растворяют 30, 3 г триса (Tris [hydroxymethyl] aminomethane) в 300-400 мл воды, доводят значение рН до 9, 1 концентрированной НСl и оставляют на 1 сутки при комнатной температуре. Затем проверяют (и при необходимости доводят еще раз) значение рН до 9, 1. Конечный объем раствора (500, 0 мл) получают добавлением дистиллированной воды.

2) 30, 3 г триса + 145 г NaCl на 500, 0 мл раствора, рН 9, 1.

3) 150, 0 г мясного экстракта (Beef Extract Powder) + 350 мл трис-буфера рН 9, 1.

Растворы автоклавируют 15 мин при 1 атмосфере (121 °С).

Рабочие разведения элюэнтов получают добавлением 9 частей стерильной дистиллированной воды к 1 части концентрированного раствора.

2.11.4.2. Подготовка макропористого стекла

Для повышения сорбционных свойств макропористое стекло, представляющее собой белый порошок, обрабатывают следующим образом:

1) один объем стекла заливают в колбе одним объемом смеси (1: 1) 3 %-ным раствором Н₂О₂ и 6 М НCl и кипятят в вытяжном шкафу в течение 1 ч (без пробки), соблюдая меры предосторожности. Полученное МПС отмывают большим количеством дистиллированной воды до нейтрального значения рН и высушивают при 100 °С;

2) в пакет из флизелина размером 5× 7 см помещают 1 г подготовленного сорбента.

2.11.4.3. Подготовка хроматографической колонки

Колонки обрабатывают силиконовой жидкостью (Serva) для предотвращения адсорбции вирусов. Для этого внутреннюю поверхность колонки смачивают данной силиконовой жидкостью, после чего колонку выдерживают 1 ч при t = 100 °С. Силиконовую жидкость можно использовать многократно.

2.11.4.4. Отбор проб и обработка проб

Пакет с сорбентом закрепляют с помощью лески так, чтобы он оказался в потоке воды. После экспозиции в течение 3-7 суток пакет вынимают, помещают в новый полиэтиленовый мешочек и стерильный флакон и транспортируют в лабораторию в сумке-холодильнике. Каждую пробу маркируют с указанием населенного пункта, точки отбора, даты установки и времени экспозиции пакета. Материал доставляют в лабораторию в максимально короткий срок (не более 6 ч). Доставленные в лабораторию пробы регистрируют в рабочем журнале.

До проведения элюции вирусов пакеты в полиэтиленовом мешке или стерильном флаконе можно хранить в холодильнике при 4 °С не более 1 суток.

В лаборатории пакет с сорбентом извлекают из транспортировочной емкости и помещают в стерильную чашку Петри. Обрезают край пакета, вымывают стекло стерильной дистиллированной водой (~ 5 мл) с помощью пипетки в эту же чашку Петри и переносят пипеткой или через воронку в колонку объемом 5-10 мл. Вирусы элюируют последовательно 3 рабочими растворами элюэнтов по 3, 0 мл каждый (рабочие разведения элюэнтов п. 2.11.4.1), собирая их в отдельные пенициллиновые флаконы.

В тех случаях, когда дальнейшие вирусологические исследования проводят на культуре клеток, полученные элюаты обрабатывают хлороформом и антибиотиками для удаления бактериальной флоры. Для этого к 1 объему элюата добавляют 1 объем хлороформа, интенсивно встряхивают 5-10 мин и центрифугируют 10 мин при 2000 об./мин для разделения фракций. Водную фракцию (верхнюю) аккуратно отбирают пипеткой в стерильный флакон и добавляют 1000 ЕД пенициллина (бензилпенициллина натриевую соль) и 10, 0 мг сульфата стрептомицина. Обработанные элюаты до заражения культур ткани можно хранить при 4 °С в течение 3 суток. При температуре –20 °С элюаты можно хранить в течение 1 года. В случае необходимости многократного исследования элюаты делят на несколько порций, чтобы избежать повторного замораживания.

Исследования полученных элюатов на наличие энтеровирусов на культуре ткани рекомендуется проводить в соответствии с " Руководством по вирусологическим исследованиям на полиомиелит" (ВОЗ, 1998).