Учтите и оцените результаты ИФА с сыворотками доноров на ВИЧ-инфекцию.

Кафедра микробиологии им. доц. Б.М. Зельмановича

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ДЛЯ ОБУЧАЮЩИХСЯ

по дисциплине «микробиология»

для специальности 060301 – Фармация (очная форма обучения)

К ЛАБОРАТОРНОМУ ЗАНЯТИЮ № 14

ТЕМА: «Серологические реакции с участием меченых антител:

иммуноферментный анализ; реакция иммунофлюаресценции прямая и непрямая»

Утверждены на кафедральном заседании

протокол № ____ от «___»____________ 20__ г.

Заведующая кафедрой микробиологии им. доц. Б.М. Зельмановича

к.б.н., доц. ___________________Перьянова О.В.

Составитель:

к.б.н., доц. ____________________Хохлова О.Е.

Красноярск

Занятие № 14

Тема: «Серологические реакции с участием меченых антител:

иммуноферментный анализ; реакция иммунофлюаресценции прямая и непрямая».

2. Форма организации занятия: лабораторное занятие.

Значение изучения темы Реакции иммунитета применяются для диагностики инфекционных и аллергических заболеваний, трансплатационного иммунитета, анализа антигенной структуры микроорганизмов, суждения об эволюционных и генетических связях различных видов микроорганизмов. Реакции иммунитета дают возможность судить о динамике защитных свойств организма в процессе инфекционных заболеваний, степени напряженности иммунитета после него и вакцинации. В основе механизма этих реакций лежит принцип тесной физико-химической связи между антигенами и антителами и специфичность их взаимодействия.

4. Цели занятия: - общая: обучающийся должен обладать ОК: способностью и готовностью анализировать социально-значимые проблемы и процессы, использовать на практике методы медико-биологических наук в различных видах профессиональной и социальной деятельности (ОК-1) и ПК: способностью и готовностью работать с научной литературой, анализировать информацию, вести поиск, превращать прочитанное в средство для решения профессиональных задач (выделять основные положения, следствия из них и предложения) (ПК-48);

- учебная: механизмы основных реакций иммунитета, используемых для диагностики инфекционных заболеваний; сущность ИФА, методику постановки, практическое использование; сущность РИФ, разновидности, методику постановки, практическое использование.

уметь оценивать результаты реакций иммунитета; учесть и оценить результаты ИФА, РИФ.

владеть навыками интерпретации результатовреакций иммунитета: ИФА, РИФ.

5. План изучения темы:

5.1. Контроль исходного уровня знаний:

Собеседование по контрольным вопросам:

· Цели использования РИФ (прямая и непрямая), ИФА.

· Критерии учета результатов РИФ, ИФА.

· Критерии достоверности результатов РИФ, ИФА.

· Достоинства РИФ, ИФА.

· Практическое использование РИФ, ИФА.

Тесты.

1. Метки, использующиеся в серологических реакциях (верно все, к р о м е):

а) щелочная фосфатаза

б) анилиновый краситель

в) флюорохромный краситель (изоционат флюоресцеина)
г) изотоп
д) пероксидаза

2. Фермент является меткой в серологической реакции:

а) РА

б) РП

в) РСК
г) ИФА
д) РИФ

3. Флюорохромный краситель является меткой в серологической реакции:

а) РП вгеле

б) коагглютинации

в) РИА
г) РИФ
д) ИФА

4. Люминесцентный микроскоп используется для учета результатов:

а) ПЦР

б) ИФА

в) РИФ
г) РСК
д) РНГА

5. Суть экспресс-диагностики инфекционных заболеваний –это определение:

а) общего титра специфических антител

б) нарастание титра специфических антител

в) IgM
г) IgG
д) специфических антигенов

6. Контроль ингредиентов серологических реакций (верно все, к р о м е):

а) позволяет исключить ложноположительные результаты

б) уменьшает кратность исследований

в) позволяет иметь достоверные результаты
г) позволяет исключить ложноотрицательные результаты
д) составляющая внутрилабораторного контроля качества
Правильный ответ: б

7. Критерий учета положительной РИФ при бактериальных инфекциях:

а) образование хромогенного продукта

б) полный гемолиз

в) выявление светящихся микроорганизмов, характерных по морфологии для предполагаемого возбудителя
г) феномен агглютинации
д) феномен преципитации

8. Преимущества ИФА (верно все, к р о м е):

а) возможность автоматизации

б) специфичность

в) визуальный учет
г) чувствительность
д) используется при инфекциях разной этиологии

9. Компоненты ИФА для серодиагностики ВИЧ-инфекции (верно все, к р о м е):

а) античеловеческая сыворотка, меченная пероксидазой

б) античеловеческая сыворотка, меченная флюорохромом

в) сыворотка обследуемого
г) тест-система, содержащая антиген ВИЧ
д) субстрат – ОФД (ортофенилендиамин)

10. Критерий учета ИФА при серодиагностике ВИЧ-инфекции:

а) наличие специфических антител

б) образование комплекса антиген-антитело

в) образование хромогенного продукта
г) ИФА «+» с сывороткой, содержащей анти-ВИЧ
д) ИФА «-» с сывороткой, не содержащей анти-ВИЧ

11. Маркер возбудителя при экспресс-диагностике инфекционных заболеваний:

а) антитела

б) антиген
в) чувствительность к антибиотикам
г) чувствительность к батериофагам
д) чувствительность к дезинфектантам

Составили: доц. Перьянова О.В.

Ст. преп. Степанова А.И.

Основные понятия и положения темы

Для проведения ИФА широко используют 96-луночные полистироловые планшеты, т. к. на полистироле легко адсорбируются антитела, а после специальной обработки – различные антигены. Для работы с этими планшетами используются многоканальные автоматические пипетки, позволяющие вносить ингредиенты одновременно в несколько лунок панели, а также автоматические и полуавтоматические устройства для промывания лунок. Существуют и специальные автоматы, позволяющие осуществлять все эти этапы ИФА практически без участия человека. Преимуществом ИФА перед классическими серологическими реакциями (РА, РНГА, РСК) является возможность определения количества антител (или антигена) без использования серийных разведений. Интенсивность окраски в лунке пропорциональна количеству фермента, следовательно, количеству искомых антител (или антигена). Измеряя с помощью спектрофотометра оптическую плотность содержимого лунки и сравнивая ее с контролем, определяют количество искомого компонента.

Достоинством ИФА при серодиагностике инфекционных заболеваний является также возможность определения классов специфических антител (Ig M, Ig G, Ig A), что имеет значение для определения периода инфекционного процесса, выявления носительства возбудителя и контроля проводимой терапии.

При этом использование для постановки ИФА моноклональных антител позволяет достичь высокой специфичности, что в сочетании с высокой чувствительностью делает ИФА одним из наиболее распространенных методом в прикладной иммунологии.

В РИФ происходит взаимодействие антигенов и антител, меченных красителями, флюоресцирующими при облучении их коротковолновым светом (ультрафиолетовым, фиолетовым, синим), например, изотиоционат флюоресцина, дающий зеленовато-желтое окрашивание. С помощью РИФ можно быстро обнаруживать даже ничтожные количества антигенов, в том числе бактериальных и вирусных, по эффекту флюоресценции комплекса «антиген + антитело» в люминесцентном микроскопе. Лучше использовать моноклональные антитела, каждое из которых нацелено против единственного антигенного эпитопа и поэтому в отличии от поликлональных антител не будет давать нежелательных перекрестных реакций с другими микроорганизмами.

5.3. Самостоятельная работа по теме:

1. Учесть и оценить результаты ИФА с сыворотками доноров на ВИЧ-инфекцию.

2. Учесть и оценить результаты РИФ (прямая) с исследуемым материалом (отделяемое карбункула) и люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой.

3. Биопрепараты: люминесцирующая сибиреязвенная сыворотка (ФИТЦ), тест-система иммуноферментная для определения антител к ВИЧ.

Учтите и оцените результаты ИФА с сыворотками доноров на ВИЧ-инфекцию.

Постановка: для определения специфических антител используют специальные панели из полистирола, в лунках которых фиксирован инактивированный вирус или его антигены. В лунки вносят сыворотки обследуемых и инкубируют. При этом гомологичные антигену антитела прикрепляются к нему. Не прикрепившиеся антитела удаляют промыванием буферным раствором. Затем в лунки вносят антитела против иммуноглобулинов (антител) человека, меченные пероксидазой. Если в исследуемой сыворотке присутствовали искомые антитела, то на данном этапе они, выступая в качестве антигена, прореагируют с меченными античеловеческими антителами. Добавление после отмывки субстрата (ортофенилендиамина – ОФД) позволяет учесть результаты реакции. Образование продукта, окрашенного в желто-коричневый цвет, оценивается как положительная реакция.

Критерием достоверности являются контроли: с сывороткой, заведомо содержащей антиВИЧ - ИФА «+» и сывороткой, заведомо не содержащей антиВИЧ — ИФА «-».