Обмен кальциевый внутриклеточный: влияние активаторов аденилатциклазы

Рассмотрим в общих чертах влияние на внутриклеточный кальциевый обмен агонистов, рецепторы которых сопряжены с аденилатциклазой. Как известно, аденилатциклаза и система обмена фосфоинозитидов и Са## - это две основные сигнальные системы, имеющиеся во всех клетках животных. Их функционирование взаимосвязано.Взаимодействие кальциевой и циклазной систем проявляется как на уровне регуляции или активности друг друга, так и посредством скоординированного влияния на биохимические процессы, происходящие в клетке (Авдонин и др., 1986; Houslay, 1991). В табл. 11 представлены данные о влиянии активаторов аденилатциклазы на рецепторзависимое увеличение Ca и на сопряженные с обменом кальция процессы.

Как видно из приведенных в табл. данных, исходя из характера гормональной регуляции среди клеток могут быть выделены два типа. В одном типе клеток агонисты, активирующие аденилатциклазу, подавляют Са-зависимые процессы и в большинстве, если не во всех случаях ингибируют подъем Ca. К этой группе относятся клетки крови: тромбоциты, лимфоциты, лейкоциты, кроме того астроциты, и по крайней мере некоторые виды гладкомышечных клеток.

Представителями клеток с противоположным характером гормональной регуляции являются гепатоциты, секреторные клетки гипофиза, околоушной железы, надпочечников, некоторые другие, в которых агонисты, стимулирующие аденилатциклазу, могут либо активировать сами, либо усиливать Са-зависимые реакции клетки. Во многих случаях такого рода синергизм связан с тем, что цАМФ потенциирует рецепторзависимое увеличение Ca.

Таблица 11. Влияние активаторов аденилатциклазы и цАМФ на Ca

АДЕНОЗИНМОНОФОСФАТ ЦИКЛИЧЕСКИЙ (аденозин-3, 5-циклофосфат; 3, 5-АМФ; цАМФ), мол. м. 329, 22; бесцв. кристаллы; — 51°; соли Na, К и аммония хорошо раств. в воде, соли Ag и двухвалентных металлов в воде практически не растворяются.

Конфигурация остатка рибозы в цАМФ- С₃-эндо-С₄-экзо. Циклофосфатное кольцо, конденсированное с рибозным циклом, имеет конформацию кресла. Кристаллич. ячейка состоит из двух молекул, в одной из к-рых аденпновое основание расположено в син-, а в другой-в анти-конформации относительно рибозного кольца. Последняя конформация характерна также для молекул в р-ре.

цАМФ-вторичный мессенджер, т.е. осуществляет ф-ции внутриклеточного посредника в действии первичных мессенджеров-ряда гормонов и медиаторов (передатчиков) нервного возбуждения. Участвует также в регуляции обмена углеводов и липидов, клеточного роста, мембранного транспорта и др. В бактериальных клетках цАМФ, взаимодействуя со специфич. рецепторным белком, вызывает в нем конформационные изменения, в результате чего белок приобретает способность связываться с клеточной ДНК и регулировать активность генов. В клетках высших организмов цАМФ активирует фермент протеинкиназу, к-рый катализирует перенос остатка фосфорной к-ты с АТФ на белок. Активация заключается в связывании цАМФ с регуляторной субъединицей фермента, в результате чего освобождается активная каталитич. субъединица, к-рая и осуществляет р-цию. Протеинкиназа может катализировать фосфорилирование нек-рых ферментов, а также ряда регуляторных и структурных белков, что приводит к изменению их св-в. Так, фермент киназа фосфорилазы b фосфорилируется с образованием активной формы, к-рая сама в свою очередь катализирует фосфорилирование др. фермента-фосфорилазы b. Последняя ускоряет распад гликогена в организме.

цАМФ оказывает влияние и на дефосфорилирование белков, к-рое осуществляется под действием протеинфосфатаз. Так, Протеинкиназа фосфорилирует один из белков, в результате чего он приобретает св-ва ингибировать фосфата-зу1-фермент, катализирующий дефосфорилирование. Метаболизм цАМФ осуществляют два фермента -аденил-атциклаза, катализирующая синтез цАМФ из АТФ, и фосфодиэстераза цАМФ, к-рая катализирует гидролиз цАМФ по З-фосфоэфирной связи с образованием 5-аденозинмонофосфата.

А. ц. открыт Э. Сазерлендом в 1957. Его получают циклизацией 5-аденозинмонофосфата под действием N, N-дициклогексилкарбодиимида.

АДЕНИЛАТЦИКЛАЗА (АТФ-, или АТР-пирофосфатлиаза циклизирующая), фермент класса лиаз, катализирующий в присут. Mg²⁺ гидролиз аденозинтрифосфата (АТФ) с образованием пирофосфорной к-ты Н₄Р₂О₇ и аденозин-монофосфата циклического (цАМФ). А. обнаружена практически во всех тканях животных, а также у бактерий. Предполагается существование этого фермента у растений. В клетках животных он локализован в плазматич. мембранах, у бактерий-в мембранах и цитоплазме. Мол. масса А. у большинства организмов неизвестна; предполагают, что она колеблется в пределах 150-600 тыс. Из ряда бактерий А. выделена в индивидуальном виде; мол. масса каталитич. субъединиц в этих А.-30-40 тыс.

Схема активации аденилатциклазы; GTP-гуанозинтрифосфат.

Функционирует А. в составе сложного комплекса, состоящего из гормонального рецептора (R), расположенного на внеш. стороне клеточной мембраны, внутримембранного регуляторного белка (G), в состав к-рого входит остаток гуанозиндифосфата (GDP), и каталитич. субъединицы (CS). Активация А. осуществляется в результате действия нек-рых гормонов, напр. глюкагона, тиреотропного, адренокортикотропного и лютеинизирующего гормонов, простагландинов группы Е. Гормон, взаимодействуя с R, образует гормон-рецепторный комплекс HorR, к-рый, реагируя с G-GDP (см. схему), вызывает каскад р-ций. Непосредственно катализирует превращение АТФ в цАМФ комплекс CS * [G-GTP], к-рый в клетке быстро распадается на CS и G-GDP.

В клетке существуют также рецепторы (напр., ацетилхолина, чувствительного к мускарину), к-рые тормозят синтез цАМФ. Эти рецепторы функционируют в комплексе с регуляторными G-белками, отличными от тех, к-рые участвуют в активации фермента. Благодаря механизму активации и ингибирования А. нейроэндокринная система может регулировать концентрацию цАМФ в клетке.

Лит. см. при ст. Аденозинмонофосфат циклический

цАМФ был открыт в конце 50-х годов прошлого века как вторичный посредник, передающий сигналы в клетку от множества гормонов, нейротрансмиттеров, простагландинов, ряда других субстанций, которые активируют аденилатциклазу. До недавнего времени считалось, что универсальным механизмом действия цАМФ является активация протеинкиназы А. В 1998 г. были обнаружены новые внутриклеточные мишени цАМФ – белки Epac1 и Epac2 (E xchange P roteins A ctivated by c AMP). Они широко распространены в организме и по крайней мере один из этих белков, Epac1, выявлен во всех исследованных тканях. Связывая цАМФ, белки Epac взаимодействуют с низкомолекулярными G-белками Rap1A/2B и стимулируют замещение ГДФ на ГТФ в их регуляторном центре, поэтому их обозначают также как cAMP-GEF (guanine nucleotide exchange factor). Белки Rap активируют протеинкиназу B-Raf, которая, в свою очередь, активирует протеинкиназный каскад MEK/Erk. Несколько позднее было установлено, что помимо Rap, белки Epac активируют специфичную к фосфоинозитидам фосфолипазу С-e, K_ATP-каналы, влияют на функционирование хлорных каналов (Holz, 2006). В кардиомиоцитах мыши выявлен макромолекулярный комплекс Epac1 с рианодиновыми рецепторами, протеинкиназой А и фосфодиэстеразой цАМФ (Dodge-Kafka et al ., 2005).

Изучение роли белков Epac в регуляции цАМФ-зависимых физиологических процессов находится на начальной стадии. Показано, что, наряду с протеинкиназой А, белки Epac активируют секрецию, влияют на межклеточные взаимодействия, процессы дифференцировки и апоптоза, принимают участие в регуляции ионных каналов и передачи сигнала в синапсе. (Holz, 2006). цАМФ играет ключевую роль в регуляции работы сердца и всей сердечно-сосудистой системы, вызывая расслабление кровеносных сосудов (Kotlikoff, 1996) и стимуляцию сократимости сердца (Kammerer, 2003). Доказано, что в реализации этих эффектов цАМФ участвует протеинкиназа А, однако роль белков Epac в проявлении действия цАМФ на сосуды и сердце не исследовалась.

Ингибирование фосфодиэстеразы. Аденозин 3’-5’-цикломонофосфат (цАМФ) и гуанозин 3’-5’-цикломонофосфат (цГМФ) играют важную роль в регуляции тонуса гладкомышечных клеток, и увеличение концентрации этих веществ причинно связано с релаксацией мускулатуры.

Внутриклеточная концентрация циклических нуклеотидов определяется их относительной скоростью образования посредством агонист-индуцируемой стимуляции аденилатциклазы (агонист - норадренолин) и гуанилатциклазы (агонист - ацетилхолин), а также скоростью их гидролиза фосфодиэстеразными ферментами клеток (ФДЭ).

ЦАМФ и цГМФ синтезируются из соответствующих нуклеозидтрифосфатов с помощью мембранносвязанных ферментов аденилатциклазы и гуанилатциклазы, соответственно. цАМФ и цГМФ инактивируются ФДЭ до неактивных нециклических рибозофосфатов.

Аденилатциклазная система универсальна; цАМФ и цГМФ являются важными внутриклеточными вторичными мессенжерами в гладкомышечных клетках различных органов (гладкая мускулатура ЖКТ, трахеи, бронхов, матки, мочеточников, сосудов, миокарда), а также клетках других тканей (тромбоциты, лимфоциты, секреторные клетки, ЦНС и т.д.); она обеспечивает различные функции (тонус мышц, секреция, агрегация и т.д.). Значительная вариация функций аденилатциклазной системы обеспечивается существованием многочисленных изоферментов ФДЭ в различных видах тканей (тканеспецифические и видоспецифические). Изоферменты ФДЭ отличаются по их физическим и кинетическим характеристикам, субстратной (цАМФ или цГМФ) специфичности, чувствительности к эндогенным активаторам и ингибиторам, чувствительности к фосфорилированию с помощью протеинкиназ, распределению в тканях и локализации в клетке. Так, различия во внутриклеточном распределении изоферментов ФДЭ является важным фактором, определяющим их индивидуальную регуляторную роль. По данным серии экспериментальных исследований установлено около 7 различных семейств ФДЭ: Ca2+-кальмодулин-зависимые (ФДЭ I), цГМФ-стимулируемые (ФДЭ II), ц-ГМФ-ингибируемые (ФДЭ III), цАМФ-специфические (ФДЭ IV), цГМФ-специфические (ФДЭ V), фотоспецифические (ФДЭ VI), высокоаффинные (устойчивые) (ФДЭ VII).

Таким образом, ФДЭ играет основную роль в регуляции тонуса гладкой мускулатуры и представляет собой удобную клеточную мишень для разработки лекарственных препаратов.

ФДЭ, выделенные из различных тканей, содержат все изоферменты, но в разных количествах. В экспериментальных исследованиях были установлены наиболее значимые типы ФДЭ в разных тканях и созданы селективные ингибиторы ФДЭ. Так, известны селективный ингибитор ФДЭ III милринон, селективный ингибитор ФДЭ IV ролипрам, селективный ингибитор ФДЭ V запринаст. Милринон является некатехоламиновым инотропным средством для кардиомиоцитов и вызывает релаксацию гладкой мускулатуры сосудов; ролипрам, по первоначальным данным, являлся ингибитором ФДЭ мозга, а затем его эффект был показан на ФДЭ IV мускулатуры дыхательных путей, клетках печени, лимфоцитов.

Результаты исследований показали, гладкая мускулатура толстого кишечника содержит почти все изоформы ФДЭ, и не только неселективные ингибиторы, но и селективные ингибиторы ФДЭ III, IV, V типов вызывали расслабление. Ролипрам, прототип селективного ингибитора ФДЭ IV, обладает наиболее выраженным спазмолитическим эффектом, как для продольной, так и поперечной мускулатуры кишечника. Эти результаты доказали, что ФДЭ IV типа функционально наиболее важна в регуляции контрактильной активности кишечника, и что селективный ингибитор ФДЭ IV может быть использован в лечении гипермоторных состояний и различных заболеваний, связанных со спастическими состояниями ЖКТ.

В гладкомышечных клетках мочевыводящих путей обнаружено существование, по крайней мере, трех различных изоформ (I, II, IV), преобладает ФДЭ IV (6).

Миометрий при беременности содержит большие дозы ФДЭ IV (50%) и ФДЭ III (10%). ФДЭ IV содержится как в начальном периоде беременности, так и в последнем триместре. Предполагается, что ФДЭ IV в конце беременности способствует (через изменение уровня цАМФ) подготовке миометрия к родами контролю за сократительной активностью матки. Использования в опыте на изолированной матки, показали, что селективные ингибиторы ФДЭ IV могут снижать чувствительность органа к окситоцину и приводить к быстрому расслаблению матки после применения максимальной концентрации окситоцина, что может быть полезно при преждевременных родах.

Протеинкиназа А представляет собой тетрамер, состоящий из двух каталитических субъединиц, связанных с регуляторной субъ- единицей димера. Подобно PKG РКА присутствует в гладкой и сердечной мышцах. Первоначально две различные формы регуля- торной субъединицы были определены, т.е. R-I и R-II, где РКА— RI-комплекс является исключительно цитозольным, а РКА— RII-комплекс полностью связан с мембраной. Современные дан- ные, однако, выявили существенную гетерогенность в обеих - каталитической и регуляторной — субъединицах РКА.

ПРОТЕИНКИНАЗЫ: СТРОЕНИЕ, КЛАССИФИКАЦИЯ, СВОЙСТВА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

Жизнедеятельность клетки невозможна без скоординированного функционирования многочисленных и разнообразных биологических катализаторов - ферментов. Большая группа ферментов, объединенная под названием " протеинкиназы", катализирует перенос концевого остатка фосфата с АТФ на различные группы в структуре белка. Протеинкиназы разделены на пять больших классов в зависимости от того, на какие группы в структуре белка переносится остаток фосфата. Протеинкиназы первого класса переносят фосфат на спиртовые группы серина и треонина. Протеинкиназы второго класса переносят фосфат на спиртовые группу тирозина. Протеинкиназы третьего класса образуют фосфоамидные связи, перенося остаток фосфата на атомы азота гистидина, лизина или аргинина. Протеинкиназы четвертого класса фосфорилируют остатки цистеина в структуре белка. Наконец, протеинкиназы пятого класса способны фосфорилировать остатки аспарагиновой и глутаминовой кислот.

В ходе реакции, катализируемой протеинкиназами двух первых классов, нейтральная спиртовая группа белка превращается в сложный эфир, несущий большой отрицательный заряд. Введение отрицательного заряда в ранее нейтральную область может приводить к значительным изменениям в структуре белка, а значит, и к изменению его свойств. Как это ни удивительно, но перенос только одного небольшого по молекулярной массе остатка фосфорной кислоты (-РО3Н2) может сопровождаться крупными структурными перестройками в молекуле белка-мишени, молекулярная масса которого может превышать десятки тысяч. Именно поэтому простая химическая модификация молекулы белка, происходящая под действием протеинкиназ, является эффективным и широко распространенным способом регуляции активности многих ферментов и других внутриклеточных белков (табл. 1). Остаток фосфорной кислоты, перенесенный протеинкиназой на спиртовую группу белка, может быть удален под действием другого фермента - фосфатазы. Таким образом, протеинкиназы и фосфатазы образуют две группы ферментов-антагонистов, способных осуществлять обратимую ковалентную модификацию белков-мишеней и тем самым регулировать их активность..

ОСНОВНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ СТРУКТУРЫ ПРОТЕИНКИНАЗ

В настоящее время в литературе описано около 200 представителей этого класса протеинкиназ. Предполагается, что в геноме млекопитающих содержится около 1000 генов, кодирующих различные протеинкиназы. Это означает, что около 1% генов млекопитающих кодирует различные протеинкиназы.

Протеинкиназы относятся к группе сложно устроенных ферментов. Действительно, по своей природе протеинкиназы вынуждены оперировать как минимум с двумя субстратами. Протеинкиназы должны иметь специальный центр связывания АТФ или других нуклеозидтрифосфатов, которые используются в качестве доноров остатков фосфата, а также специальный центр связывания белка-субстрата, на который осуществляется перенос фосфатной группы (рис. 1). Для того чтобы осуществить перенос фосфата с АТФ на белок, нужен специальный активный центр, содержащий определенные аминокислотные остатки, которые непосредственно участвуют в переносе фосфата от АТР на белок. Ясно, что два субстратсвязывающих участка (участок связывания АТФ и участок связывания белка-субстрата) должны располагаться поблизости и быть соответствующим образом ориентированы относительно друг друга. Только в этом случае становится возможным эффективный перенос остатка фосфата. Субстратсвязывающие участки должны обладать достаточно высокой специфичностью. Это означает, что протеинкиназы должны узнавать только свои субстраты, то есть связывать и фосфорилировать вполне определенные белки. Итак, все протеинкиназы должны иметь в своем составе два субстратсвязывающих участка и каталитический центр, обеспечивающий собственно процесс фосфорилирования.

Кроме этого исполнительного механизма протеинкиназы должны иметь в своей структуре специальные регуляторные элементы. Если бы протеинкиназа непрерывно и бесконтрольно катализировала фосфорилирование белков-субстратов, то в клетке наступил бы хаос. Произошло бы разбалансирование многочисленных реакций, протекающих в клетке. Практически все протеинкиназы имеют разнообразные, зачастую сложно устроенные регуляторные центры. Некоторые протеинкиназы имеют специальные регуляторные центры, которые связывают низкомолекулярные клеточные метаболиты (например, АМФ) или определенные сигнальные молекулы (такие, как циклическая ГМФ, ионы кальция или специальные фосфолипиды, см. рис. 1). Другие протеинкиназы имеют специальные центры для связывания регуляторных белков. Эти белки способны прикреплять протеинкиназы к определенным структурам внутри клетки или выступать в качестве специальных сенсоров, способных связывать низкомолекулярные сигнальные молекулы и регулировать активность протеинкиназ. Наконец, в структуре большинства протеинкиназ есть специальные участки, которые могут фосфорилироваться (рис. 1). В некоторых случаях протеинкиназа может катализировать свое собственное фосфорилирование (так называемое самофосфорилирование) и тем самым регулировать собственную активность. В иных случаях другие, часто высоко специализированные протеинкиназы осуществляют фосфорилирование и регуляцию активности данной протеинкиназы. В литературе описаны примеры, когда активность протеинкиназы регулируется всеми тремя описанными выше способами.

ТРЕХМЕРНАЯ СТРУКТУРА ПРОТЕИНКИНАЗ

В настоящее время описана кристаллическая структура нескольких протеинкиназ, способных осуществлять фосфорилирование как остатков серина и треонина (Ser / Thr-протеинкиназы), так и остатков тирозина (Tyr-киназы). Несмотря на то что эти ферменты имеют разную субстратную специфичность, регулируются различными низкомолекулярными соединениями и взаимодействуют с разными регуляторными белками, трехмерная структура их каталитического участка имеет много общих черт.

Каталитический домен (то есть участок молекулы белка, обеспечивающий собственно перенос фосфата с АТФ на белок) большинства протеинкиназ состоит как бы из двух долей, соединенных гибким шарниром (рис. 2). Верхняя N-концевая доля содержит в своем составе пять антипараллельных b-структурных участков (характерных элементов укладки полипептидной цепи белка, подробно описанных в [1]). Эти элементы изображены в виде пронумерованных красных стрелок на рис. 2, а. Помимо этого в состав N-концевой доли входит от одной до трех относительно коротких a-спиралей (характерная укладка полипептидной цепи, напоминающая скрученную пружину [1], изображенная в виде спиралей красного цвета на рис. 2, а). Эта N-концевая часть молекулы белка отвечает за связывание АТФ (или другого нуклеозидтрифосфата) и его правильную ориентацию относительно каталитического и белоксвязывающего центров. Нижняя С-концевая бЧльшая по своим размерам часть каталитического домена содержит пять относительно длинных a-спиральных участков (D, E, F, G и H на рис. 2, а), которые формируют своеобразный фундамент для всего каталитического домена. Две доли каталитического домена соединены шарниром, который сформирован из трех коротких b-структурных участков (стрелки 6, 7 и 8 на рис. 2, а), соединенных гибкими петлями и иногда короткими a-спиралями. В петле между b-структурными участками 6 и 7 располагается собственно каталитический участок. Короткий b-структурный участок (стрелка 9 на рис. 2, а) и участок полипептидной цепи, соединяющий восьмой b-структурный участок (стрелка 8 на рис. 2, а, б) со спиралью F, участвуют в связывании белкового субстрата. Кроме того, в некоторых случаях в этом участке полипептидной цепи располагаются остатки, которые могут подвергаться фосфорилированию. Таким образом, в трехмерной структуре каталитического домена большинства протеинкиназ есть как бы две доли, соединенные гибким шарниром. Верхняя доля обеспечивает связывание АТФ, а нижняя - связывание белкового субстрата. Катализ осуществляется при участии аминокислотных остатков, расположенных в шарнирном участке.

Подробный анализ трехмерной структуры белка достаточно сложен, поэтому обратимся к упрощенному двухмерному изображению каталитического домена Ser / Thr-протеинкиназ (рис. 2, б). На рисунке четко видны две части каталитического домена: содержащая преимущественно b-структурные участки N-концевая часть (отмечена красным цветом) и содержащая преимущественно a-спирали С-концевая часть (отмечена синим цветом). Катализ становится возможным только в том случае, если участки связывания АТФ (Р на рис. 2, б), каталитический центр (К на рис. 2, б), центр связывания ионов магния (М на рис. 2, б) и центр связывания белка-субстрата (Т на рис. 2, б) будут правильным образом ориентированы относительно друг друга. Таким образом, регулируя подвижность шарнира, соединяющего две доли каталитического домена, или влияя на ориентацию каталитического и белоксвязывающего участков, можно регулировать активность протеинкиназ. Например, фосфорилирование остатков треонина и тирозина, расположенных в петле, соединяющей восьмой b-структурный участок и спираль F (рис. 2, б), фиксирует правильную ориентацию двух долей каталитического домена протеинкиназы, регулируемой специальными белками циклинами, а также МАР-киназы (Mitogen Activated Protein kinase, то есть протеинкиназы, активируемой факторами, управляющими процессами клеточного деления, митогенами). Поэтому фосфорилирование этих протеинкиназ сопровождается значительным увеличением их ферментативной активности.

В рассмотренных примерах проанализировано строение каталитического домена двух Ser / Thr-протеинкиназ. Активность этих ферментов (цАМФ-зависимой протеинкиназы и циклинзависимой протеинкиназы) регулируется путем фосфорилирования определенных участков, расположенных вблизи активного центра, и путем взаимодействия со специфическими белками-регуляторами (специальной ингибиторной регуляторной субъединицей в случае цАМФ-зависимой протеинкиназы и специальных активаторов - циклинов в случае циклинзависимой протеинкиназы). Рассмотрим строение одного из представителей так называемых Tyr-протеинкиназ, то есть ферментов, способных фосфорилировать остатки тирозина в структуре белка субстрата.

Одна из Tyr-киназ получила название " src-киназа". Такое название связано с тем, что саркому Рауса (отсюда src) птиц могут вызывать определенные вирусы, в геноме которых есть ген, кодирующий эту протеинкиназу. Как видно из рис. 3, в структуре src-киназы можно выделить две части. В левой части (желтая и зеленая на рис. 3) располагаются специальные регуляторные элементы, а в правой части (светло- и темно-синяя на рис. 3) размещается каталитический домен. Строение этого каталитического домена удивительно похоже на строение каталитического домена Ser / Thr-протеинкиназ. Действительно, верхний (светло-голубой) субдомен, содержащий преимущественно b-структурные участки, участвует в связывании АТФ, а в нижнем (темно-синем) субдомене располагается центр связывания белка-субстрата. Активный центр находится в щели, разделяющей светло- и темно-синие субдомены. Вблизи активного центра располагается гибкая петля (изображена в виде пунктира), которая может участвовать в регуляции активности фермента.

Вероятно, наибольший интерес представляет регуляторный домен src-киназы. В N-концевой части src-киназы располагаются два участка с консервативной первичной структурой. Первый, так называемый SH3-мотив (SH расшифровывается как src-homology, то есть гомология с src-киназой) встречается в структуре многих белков. Этот относительно консервативный участок, часто обозначаемый термином " мотив", способен узнавать и прочно взаимодействовать с участками полипептидных цепей, имеющих в своей структуре определенным образом расположенные остатки пролина (так называемая полипролиновая спираль II типа). В структуре src-киназы такой участок (отмечен красным цветом на рис. 3) находится в области шарнира между регуляторным и каталитическим доменами. Таким образом, расположенный в N-концевой области SH3 может регулировать ориентацию АТФ-связывающего участка в каталитическом домене белка. Второй регуляторный элемент, располагающийся в N-концевой части белка, представлен так называемым SH2-мотивом (отмечен желтым цветом на рис. 3). Последовательность аминокислот в SH2-мотиве тоже достаточно консервативна и встречается в составе многих белков. Первичная структура SH2-мотива обеспечивает узнавание и связывание с участками полипептидной цепи, имеющими в своем составе остатки фосфорилированного тирозина. В С-концевой области фермента (обозначена оранжевым цветом на рис. 3) есть остаток тирозина, который может фосфорилироваться или под действием самой src-киназы, или под действием других Tyr-киназ. Если это происходит, то фосфотирозин попадает в так называемый карман для фосфотирозина, являющийся главной составной частью SH2-мотива. При этом происходит переориентация С-концевого участка каталитического домена и оказывается невозможным протекание каталитической реакции. Таким образом, SH3 контролирует ориентацию АТФ-связывающего участка, а SH2 - ориентацию субстратсвязывающего участка.

В ингибированном состоянии SH2- и SH3-участки регуляторного домена узнают и взаимодействуют со специальными участками в структуре каталитического домена одной и той же молекулы фермента. Важно отметить, что участки, узнаваемые SH2- и SH3-мотивами, широко распространены и встречаются в структурах многих белков. Если src-киназа оказывается поблизости от белков, содержащих в своей структуре полипролиновые спирали или фосфорилированные остатки тирозина, то регуляторные элементы фермента как бы получают возможность выбора. SH2- и SH3-участки данной молекулы фермента могут либо оставаться в контакте с соответствующими группами внутри своей же молекулы белка, либо контактировать с соответствующими группами в структуре другой молекулы белка-партнера. Если регуляторные участки " отвлекаются" от блокирования собственного каталитического центра, то фермент приобретает активность и начинает катализировать фосфорилирование белков субстратов. Одновременно с этим за счет межмолекулярных взаимодействий src-киназа оказывается прикрепленной к совершенно определенным белкам-якорям. Эти белки обеспечивают адресное распределение протеинкиназы внутри клетки. Таким образом, в структуре полипептидной цепи src-киназы есть все элементы, необходимые для управляемого катализа и определенной ориентации фермента внутри клетки.

Приведенные примеры убедительно свидетельствуют о том, что общая архитектура строения каталитического домена различных протеинкиназ довольно консервативна. В то же время в первичной структуре каталитических доменов различных протеинкиназ есть определенные различия, которые, впрочем, не приводят к драматическому изменению укладки полипептидной цепи. Регуляторные элементы различных протеинкиназ крайне разнообразны. Как уже отмечалось, активность протеинкиназ может регулироваться низкомолекулярными соединениями, специальными белками - активаторами или ингибиторами, а также путем фосфорилирования. Есть несколько способов классификации протеинкиназ. Первые классификации были основаны на различиях в способе регуляции активности. Такие классификации просты и наглядны, однако они не учитывают сходства в первичных структурах анализируемых белков и поэтому не могут быть использованы для установления эволюционных отношений в семействе протеинкиназ. Современная классификация протеинкиназ основывается на сопоставлении первичных структур каталитических доменов.

КЛАССИФИКАЦИЯ ПРОТЕИНКИНАЗ

По мере накопления сведений о первичной структуре протеинкиназ и установлении трехмерной структуры некоторых представителей этого класса ферментов стало возможным создание классификации, в основу которой положен анализ последовательности аминокислот в каталитическом домене фермента (табл. 2). К первому, так называемому A-G-C-классу относят ферменты, активность которых регулируется циклическим АМФ (буква А в названии класса), циклическим ГМФ (буква G в названии класса) и так называемые протеинкиназы С (буква С в названии класса), активность которых может регулироваться диацилглицеролом, фосфолипидами и ионами кальция. Ферменты этого класса могут быть мономерными белками (как, например, протеинкиназа С), где все регуляторные элементы находятся в составе одной полипептидной цепи. Другие представители этого класса могут быть димерами (цГМФ-зависимая протеинкиназа) или гетероолигомерами (цАМФ-зависимая протеинкиназа, см. табл. 2). В этом случае регуляция активности может осуществляться либо путем изменения структуры димера, либо путем обратимой ассоциации каталитических и регуляторных субъединиц. Активность ферментов класса A-G-C регулируется различными так называемыми вторичными посредниками (цАМФ, цГМФ, кальций, фосфолипиды), концентрация которых внутри клетки может меняться под действием первичных посредников (гормонов, гормоноподобных веществ и электрической стимуляции).

Второй класс протеинкиназ обозначен как Са-кальмодулин-зависимые протеинкиназы (см. табл. 2). Ферменты этого класса, как правило, состоят из каталитической и одной или нескольких регуляторных субъединиц. В подклассе истинных Са-кальмодулинзависимых протеинкиназ одной из регуляторных субъединиц обязательно является кальмодулин - универсальный Са-связывающий белок, широко распространенный в различных органах и тканях [3]. При этом кальмодулин может прочно взаимодействовать с каталитической субъединицей и являться интегральной частью фермента (как, например, в случае киназы фосфорилазы) или взаимодействовать и активировать каталитическую субъединицу только в определенных условиях (как, например, в случае киназы легких цепей миозина). Некоторые представители этого подкласса способны образовывать сложные олигомерные комплексы (например, многофункциональная Са-кальмодулинзависимая протеинкиназа II типа, см. табл. 2). В этой группе ферментов выделяют отдельный подкласс сложно построенных протеинкиназ, активность которых зависит от концентрации АМФ (см. табл. 2). Повышение концентрации АМФ свидетельствует об истощении энергетических ресурсов клетки. Поэтому, связываясь с ферментом, АМФ активирует протеинкиназу, которая фосфорилирует определенные белки-мишени и тем самым ингибирует энергопотребляющие и активирует энергосберегающие процессы в клетке.

Третий C-M-G-класс протеинкиназ довольно гетерогенен. К этому классу относят циклинзависимые протеинкиназы (буква C в названии), так называемые МАР-киназы (буква М в названии) и ферменты, способные фосфорилировать гликогенсинтазу (фермент, участвующий в синтезе гликогена) (буква G в названии). Ферменты этого класса могут быть мономерами (как, например, МАР-киназа) или образовывать комплексы со специальными регуляторными субъединицами (циклинзависимые протеинкиназы, казеинкиназа II типа). Активность этих протеинкиназ регулируется различными внутриклеточными метаболитами (например, полиаминами), а также путем самофосфорилирования или фосфорилирования под действием специальных протеинкиназ. В этом случае сама протеинкиназа (например, МАР-киназа) является субстратом для другой протеинкиназы, активность которой, в свою очередь, может регулироваться либо путем фосфорилирования, либо под действием какого-то вторичного посредника (цАМФ, ионы кальция, специальные фосфолипиды). Фосфорилирование вообще является одним из наиболее универсальных способов регуляции активности протеинкиназ (см. табл. 2).

Четвертый класс представлен различными Tyr-киназами. К этому классу отнесены протеинкиназы, способные фосфорилировать остатки тирозина в белках-мишенях. Описано несколько подклассов растворимых Tyr-киназ, примером которых может быть src-киназа, описанная в предыдущем разделе. Помимо этого известны несколько классов мембрансвязанных протеинкиназ. Это сложно построенные белки, состоящие как бы из трех частей (рис. 4). Одна часть белка, расположенная с наружной стороны клетки, выполняет функции своеобразной антенны и улавливает (связывает) специфические гормоны (например, инсулин, эпидермальный фактор роста). Другая часть белка обеспечивает его встраивание в мембрану и удержание в правильной ориентации. Наконец, третья, цитозольная часть белка содержит в своем составе каталитический домен, способный осуществлять фосфорилирование по остаткам тирозина. Фосфорилированию может подвергаться как сам фермент-рецептор, так и другие белки-субстраты (см. рис. 4). При этом фосфорилирование возможно только до тех пор, пока наружная часть белка находится в комплексе с гормоном. Как уже отмечалось, в структуре многих цитозольных белков есть специальные SH2-мотивы, которые способны узнавать и взаимодействовать с фосфорилированными остатками тирозина. Поэтому сразу после самофосфорилирования рецептор оказывается способным взаимодействовать с цитозольными белками, имеющими в своей структуре SH2-мотив (полукруг на рис. 4). Такой " прилипший" к рецептору цитозольный белок, в свою очередь, может стать субстратом для фосфорилирования по остаткам тирозина, и к нему могут " прилипать" другие цитозольные белки. Вследствие такой последовательности реакций на цитозольной стороне рецептора может собираться гирлянда белков, часть из которых может быть ферментами, функционирующими только в составе таких сложных многокомпонентных комплексов.

В пятый класс объединены неклассифицированные протеинкиназы. Эти зачастую мономерные ферменты, активность которых может регулироваться под действием низкомолекулярных клеточных метаболитов (см. табл. 2). Часть этих ферментов обладает необычной смешанной специфичностью и способна фосфорилировать как остатки серина и треонина, так и остатки тирозина (киназа МАР-киназы).

2.4.Предсердный натрийуретический пептид (ANF). Мембранносвязанная гуанилатциклаза. Строение и механизм функционирования тирозинкиназного рецептора.

ANP - гормон белковой природы, синтезируемый в миоцитах предсердия как прогормон, и накапливающийся в секреторных гранулах в виде белковой цепочки длиной в 126 аминокислотных остатка. Небольшие количества образуются в клетках желудочков. Некоторые количества ANP синтезируются в легких и нейронами центральной и периферической нервной систем. ANP секретируется в ответ на растяжение предсердий (увеличение объема внутрисосудистой жидкости при различных патологических состояниях, изменение положения тела из вертикального в горизонтальное, физическая нагрузка).

Выработка ANP возрастает под влиянием глюкокортикоидов, -адренорецепторов. Первичной тканью-мишенью дляaвазопрессина, эндотелина или ANP служат почки, но он действует также на периферическое сопротивление артерий. В почках ANP усиливает тонус приводящих артериол, тем самым повышает давление в клубочке, т.е. увеличивает фильтрационное давление. ANP способен сам по себе усиливать фильтрацию, даже если внутриклубочковое давление не меняется. Это приводит к увеличению экскреции натрия вместе с большим количеством первичной мочи. Увеличение экскреции натрия дополнительно обусловлено подавлением ANP секреции ренина юкстагломерулярным аппаратом. Также экскреция натрия усиливается путем прямого действия ANP на проксимальные канальцы нефрона и непрямого ингибирования синтеза и секреции альдостерона. ANP ингибирует секрецию вазопрессина из задней доли гипофиза. Все эти механизмы в конечном счете направлены на то, чтобы вернуть к норме увеличенное количество натрия и увеличенный объем воды в организме, возникшие в результате патологических воздействий. Факторы, активирующие ANP, противоположны тем, которые стимулируют образование ангиотензина II.

В плазме крови ANP находится в виде нескольких форм прогормона. При освобождении прогормон выделяется в эквимолярных количествах в виде proANP (99-126) с высокой биологической активностью, также известным как - -ANP связывается сa-ANP (ANP 1-28), и N-терминальной части - proANP (1-98). a -ANP составляет 3-4 минуты.aопределенными рецепторами. Период полураспада Никакие рецепторы для proANP (1-98) на сегодняшний день неизвестны, и этот пептид циркулирует дольше, что ведет к существенно более высоким концентрациям в -ANP.aкрови по сравнению с

В клинических исследованиях было показано, что уровень proANP (1-98) в плазме -ANP в раннем периоде сердечной дисфункции. Такимaв 50 раз выше, чем уровень образом, уровень proANP (1-98) менее чувствителен к пульсации секреции ANP и может лучше отражать постоянную секрецию ANP, чем быстро колеблющиеся уровни -ANP. ProANP (1-98) далее расщепляется на две формы: proANP (1-30) и proANPa (31-67). ProANP (31-67) является предоминантным иммунореактивным эпитопом в моче.

Концентрация ANP в плазме повышается у пациентов с недостаточностью митрального клапана, остановкой сердца, прогрессирующим ухудшением гемодинамики. У беременных с преэклампсией концентрация proANP резко повышается.

Следует отметить, что стабильность proANP и proBNP очень высока: в образцах плазмы белок стабилен три дня при комнатной температуре, что позволяет направить пробу на исследование этого показателя даже на следующий день. В отличие от -ANP, требующих твердофазнойaмногих тест-систем для определения BNP-32 и экстракции образца перед анализом, proANP и proBNP могут быть определены непосредственно в биологическом образ