V. Учебная информация для использования на занятии.

Нервная ткань является основой строения органов нервной системы, обеспечивающих регуляцию всех тканей и органов, их интеграцию в организме и связь с окружающей средой.

Организм животных находится под постоянным воздействием окружающей среды. С помощью специализированных структур нервной ткани обеспечивается возможность восприятия различных факторов, их анализа и выработки ответных реакций. С помощью элементов нервной ткани организм животных быстро приспосабливается (адаптируется) к изменяющимся условиям внешней и внутренней среды.

Развитие нервной ткани.

Нервные клетки начинают развиваться на ранней стадии эмбриогенеза из нервной пластинки, сформированной из пласта эктодермальных клеток, расположенных на дорсальной поверхности зародыша.

Через стадию нервного желобка нервная пластинка замыкается в нервную трубку. После замыкания нервной трубки в ее стенке усиливается размножение клеток, затем клетки прекращают делиться и мигрируют к наружной зоне трубки. Одни из них становятся предшественниками нейронов-нейробластами, другие предшественниками глиоцитов, сохраняющими способность к делению. Из передней части нервной трубки формируется нервная ткань головного мозга, из остальной – спинного мозга. При формировании нервной трубки часть клеток нервной пластинки не входит в ее состав и образует по бокам нервный гребень или ганглиозную пластинку из которой в дальнейшем формируются нейроны и глиоциты спинномозговых и вегетативных ганглиев, клетки мягкой мозговой и паутинных оболочек мозга, клетки мозгового вещества надпочечников, меланоциты кожи.

Кроме нервного гребня по бокам нервной трубки в краниальном отделе формируется нейральные плакоды в виде утолщений. Из них впоследствии развиваются нервные элементы органов слуха и равновесия, ганглии головы.

В нервной трубке можно выделить три зоны: эпендимная, плащевая и маргинальная. В эпендимной зоне есть матричные (вентрикулярные) клетки, которые размножаются, и дифференцируются в 2-х направлениях: нейробласты, являющиеся источником образования нейронов и глиобласты, дающие начало макроглии. Часть матричных клеток остается в эпендимном слое и дифференцируется в эпендимную глию.

Во время развития нервной трубки из клеток сосудистого сплетения pia mater появляется радиальная глия (РГ) которая затем мигрирует внутрь нервной трубки. Биполярные клетки РГ устроены асимметрично: перивентрикулярный отросток клетки, обращенный к эпендимному слою, обычно укорочен. Противоположный отросток пронизывает всю толщу нервной трубки. По отросткам РГ нейробласты мигрируют в плащевой слой (будущее серое вещество). Маргинальная (краевая) зона дает начало белому веществу, состоящему из аксонов нейробластов.

В постнатальном периоде клетки РГ превращаются в астроглию, реже – нейроны. В растущем мозжечке РГ получила название Бергмановской глии, она служит " рельсами" для миграции клеток Пуркинье. В отличие от РГ остального мозга, которая исчезает в постнатальном периоде, Бергмановская глия функционирует в постнанатальном периоде, когда завершается формирование архитектоники клеточных слоев мозжечка.

В постнатальном периоде нейральные стволовые клетки (НСК) сохраняются в эпендиме и субэпендимальном слое вокруг желудочков, а также в гиппокампе, обонятельной луковице, коре и других структурах. Перивентрикулярная область взрослого мозга млекопитающих остается " реликтом" эмбрионального мозга с остатками стволовых ниш. В этих зонах сохраняются гетерогенные популяции плюрипотентных клеток.

Строение нервной ткани.

Нервная ткань состоит из двух связанных между собой популяций клеток: нейронов и глиоцитов (нейроглии).

Нейроны обеспечивают основные функции нервной ткани: восприятие раздражения, возбуждение, формирование нервного импульса, передачу импульса рабочим органам (мышцам, железам).

В нейроне различают тело (перикарион), в котором располагается крупное ядро, хорошо развитая гранулярная эндоплазматическая сеть, аппарат Гольджи, другие органелы и включения. От тела отходят отростки – один аксон (нейрит) и один или несколько дендритов, обычно ветвящихся. По числу отростков нейроны делят на: униполярные с одним отростком, биполярные – с двумя, мультиполярные – с тремя и более отростков. Один отросток аксон отводит нервный импульс от тела нейрона. Он относительно прямой в сравнении с дендритами и более длинный; не ветвится. У некоторых нейронов от аксонов под прямым углом отходят отростки (коллатерали). Дендриты несут воспринятое раздражение к телу нейрона. Отростки заканчиваются нервными окончаниями.

По форме нейроны бывают: округлые, веретенообразные, пирамидальные, звездчатые, грушевидные, то есть самые разнообразные.

По размеру также наблюдаются большие различия от 4 мкм до 150 мкм.

По функциональному значению нейроны бывают: рецепторные или чувствительные (афферентные), специализирующиеся на восприятии раздражении из окружающей среды или внутренних органов; двигательные, которые проводят импульсы на рабочие органы (скелетные мышцы, железы); ассоциативные или вставочные, являющиеся связующими звеньями между чувствительными и двигательными нейронами, они преобладают в нервной системе; секреторные нейроны, которые могут вырабатывать нейросекреты в виде гормонов (в гипоталамусе, мозговом веществе надпочечников).

По составу нейромедиатора нейроны бывают: холинергические – нейромедиатор ацетилхолин (ядро блуждающего нерва, передние рога спинного мозга и др.); адренергические – норадреналин (симпатический отдел вегетативной нервной системы); пептидергические – различные аминокислоты (нейросекреторные клетки); дофаминергические – дофамин (базальные ядра мозга); серотонинергичекие – серотонини др.

По длине аксона - клетки Гольджи I типа – длинноаксонные; II типа – короткоаксонные.

По характеру воспринимаемого сигнала - механорецепторные, зрительные, обонятельные и др.

Для большинства нейронов характерно расположение ядер в центре. В перикарионах крупных нервных клеток ядра светлые с дисперсным хроматином с хорошо выраженным темным ядрышком.

В постэмбриональный период жизни организма нервные клетки не делятся, и поэтому их ядра находятся в состоянии интерфазы. Большая часть хроматина имеет диффузное или дисперсное состояние, что, наряду с большим количеством базофильных глыбок в цитоплазме перикариона, свидетельствует о высокой интенсивности белкового синтеза. Базофильные глыбки (тигроид, хроматофильное вещество) представляют собой скопления цистерн гранулярной эндоплазматической сети и свидетельствуют о наличии большого количества нуклеиновых кислот и аминокислот. Ученые подсчитали, что в одной нервной клетке за одну секунду синтезируется до 10 тысяч белковых молекул. Гранулярная эндоплазматическая сеть и свободные полисомы в аксонах отсутствуют, и поэтому синтез белков в них невозможен. Аппарат Гольджи в нейронах очень развит и его цистерны окружают ядро со всех сторон. Он участвует в образовании лизосом, медиаторов, транспортных рецепторных белков, а так же белков для восстановления структур в цитоплазме клетки. Структуры нейронов возобновляются в течении трех суток. В гладкой эндоплазматической сети синтезируются углеводы, липиды. В цитоплазме нейронов и в отростках много митохондрий. Они обеспечивают энергией процессы, связанные с синтезом белка и транспортом веществ от тела в отростки, и из отростков в тело нейрона. Много митохондрий наблюдается в аксональных холмиках (в местах выхода аксона), в толстых дендритах, по всей длине аксонов, в нервных окончаниях и синапсах (местах контактов нейронов). В цитоплазме нейронов много специальных структур – нейрофибрилл, которые выявляются при импрегнации азотнокислым серебром. Они образуют густую сеть в теле нейрона (перекарионе) и дендритах, а в аксонах располагаются параллельно их оси. Ультраструктура нейрофибрилл представлена пучками переплетающихся нейрофиламентов толщиной 7 нм и нейротрубочек толщиной 24 нм. Нейрофибриллы имеют существенное значение для поддержания формы отростков, а также для передвижения продуктов синтеза из перикариона к концам аксона и дендрита.

Обнаружено, что в теле и отростках нейрона происходит непрерывная циркуляция аксоплазмы от перикариона (антероградный ток) и назад к нему (ретроградный ток).

Антероградный ток:

a) Медленный поток 0, 1-3 мм/сут., несет вновь синтезированную аксоплазму к окончанию аксона (сам аксон не синтезирует). Влияют перистальтические сокращения глиальной оболочки.

b) Быстрый поток – 100-500 мм/сут., в нейросекреторных нейронах гипоталамуса до 2800 мм/сут. Несет вещества необходимые для синаптической функции: ферменты, гликопротеиды, фосфолипиды, митохондрии и др.

Ретроградный ток – в обратном направлении от окончания к перикариону со скоростью быстрого потока, перемещение белков и других веществ, захваченных нервными окончаниями.

Дендритный транспорт – некоторые белки, ферменты (ацетилхолинэстераза) транспортируются от тела к дендритам со скоростью медленного потока (3мм/сут.)

Транспорт веществ обеспечивают микротрубочки и связанные с ними белки кинезиныи динеины с затратой АТФ. Они связываются с органеллами и другими переносимыми веществами. Кинезин осуществляет антероградный транспорт, динеины – ретроградный транспорт по поверхности, а не внутри трубочек.

Трансверсальный транспорт - подача кислорода, энергетических субстратов и удаление продуктов метаболизма происходят через местное кровяностное русло в области перехватов миелина (Ранвье). После прекращения кровоснабжения нервное волокно теряет способность к проведению возбуждения.

Возрастные изменения нервной ткани.

Возрастные изменения в нервной ткани связаны с утратой нейроцитов в постнатальном периоде способности к делению, и как следствие этого постепенным уменьшением количества нейроцитов, особенно чувствительных, а также уменьшением уровня метаболических процессов в оставшихся нейроцитах. Все это выражается закономерным накоплением включений липофусцина (" пигмент старения") в цитоплазме.

Морфологические изменения нервных клеток при повреждении, особенности регенерации.

Важную роль в повреждении нервных клеток играют нарушение микроциркуляции, деструкция нейроглии и нарушение нейротрофической стимуляции. Наиболее чувствительными к повреждению органеллами являются митохондрии, что приводит к нарушению функции тканевого дыхания и развитию окислительного стресса. Выход в гиалоплазму цитохрома С, в результате разрушения митохондриальных мембран, активизирует перекисное окисление липидов, а также индуцирует апоптоз клетки.

Поражение нейронов встречается в двух формах - это хроматолиз и гиперхромия со сморщиванием (пикноморфные нейроны). Эти изменения неспецифичны и встречаются при гипоксии мозга, после воздействия на сетчатку ионизирующей радиации, микроволн, света.

В зависимости от распределения и содержания хроматофильного вещества хроматолиз может быть очаговым и тотальным. Очаговый хроматолиз является обратимым изменением нейронов и отражает нарушение обмена функциональных белков. В дальнейшем он может нарастать, и в процесс вовлекаются структурные белки клеток, что приводит к развитию необратимой стадии - тотального хроматолиза.

Гиперхромные нейроны, также могут существовать в двух состояниях: обратимом и необратимом. Появление нейронов с гиперхромией ядра и цитоплазмы указывает на активное функциональное состояние этих клеток и адаптационные процессы, протекающие в нервной ткани при воздействии повреждающих факторов. Необратимое состояние – гиперхромия со сморщиванием, характеризующееся деформацией ядра и перикариона, высокой электронной плотностью карио- и цитоплазмы, редукцией органелл, повышением содержания первичных и вторичных лизосом.

Рассматривая процессы регенерации в нервных тканях следует сказать, что нейроциты являются наиболее высокоспециализированными клетками организма и поэтому утратили способность к митозу. Физиологическая регенерация (восполнение естественного износа) в нейроцитах хорошая и протекает по типу " внутриклеточной регенерации" - т.е. клетка не делится, но интенсивно обновляет изношенные органоиды и другие внутриклеточные структуры. Для этого в нейроцитах хорошо выражены гранулярный ЭПС, пластинчатый комплекс и митохондрии, т.е. имеется мощный синтетический аппарат для синтеза органических компонентов внутриклеточных структур.
Отсутствие клеточной формы регенерации нейроцитов обуславливает раз-растание нейроглии и соединительной ткани на месте повреждения (репара-тивная регенерация - восстановление после повреждений).

Однако в некоторых областях мозга возможен нейрогенез, в частности н овые нейроны обнаружены:

• у крыс в таламусе и коре большого мозга после разрушения латерального коленчатого тела (Олтман, 1962)

• в обонятельных луковицах и коре гиппокампа (250000 в месяц, обновление 3% нейронов, живут 112 сут, смещаются на 2 см)

• у птиц в вокальном центре

• у амфибий (обновление, как и у крыс, птиц, осуществляется за счёт нервных стволовых клеток, расположенных вблизи боковых желудочков головного мозга)

• у человека (онкобольных, леченных бром-диоксиуридином, практически во всех отделах мозга обнаруживается химиотерапевтический препарат, он накапливается исключительно в делящихся клетках)

В случае повреждения только отростка нейроцита регенерация протекает успешно при наличии определенных для этого условий. При этом, дистальнее места повреждения осевой цилиндр нервного волокна подвергается деструкции и рассасывается, но леммоциты при этом остаются жизнеспособными. Свободный конец осевого цилиндра выше места повреждения утолщается - образуется " колба роста", и начинает расти со скоростью 1 мм/день вдоль оставшихся в живых леммоцитов поврежденного нервного волокна, т.е. эти леммоциты играют роль " проводника" для растущего осевого цилиндра. При благоприятных условиях растущий осевой цилиндр достигает бывшего рецепторного или эффекторного концевого аппарата и формирует новый концевой аппарат. Для нормальной регенерации волокна необходимо:
1. Своевременная хирургическая обработка очага повреждения (иссечение нежизнеспособных тканей, кровяных сгустков).
2. Обеспечение контакта центрального и дистального фрагмента нервного волокна в зоне повреждения (наложение шва " конец в конец" на поврежденном волокне).

3. Обеспечение нормального кровоснабжения поврежденного нервного во-локна по всей длине (сшивание поврежденных кровеносных сосудов, со-провождающих нерв).

4. Раннее назначение дозированной физической нагрузки и массажа поврежденной конечности.

Нейротрансплантация.

Для трансплантации используют кусочки мозгаразмером 1, 5 мкм³, свежезабранные от нескольких эмбрионов и криоконсервированные, замороженные до -70^оС в парах сухого льда с добавлением диметилсульфоксида или в жидком азоте до -196^оС, суспензии клеток, диссоциированных трипсином или механически, изолированные клетки кратковременно и длительно культивированные клетки эмбрионального мозга, глио-нейронные агрегаты, генетически модифицированные клетки (эмбриональные миоциты, фибробласты, эндотелиоциты), стволовые клетки на предимплантационной стадии развития зародыша, нейроэктодермы и региональные, окружённые мезенхимой (в эмбриональном мозге их мало). Для трансплантации используется материал эмбрионов, плодов и новорождённых (чем «моложе» нервная ткань, тем она лучше приживляется).

Трансплантируют нервную тканьна поверхность мягкой мозговой оболочки (субарахноидально), внутрь мозга (интрапаренхимально), спинного – интрамедуллярно, эндолюмбально, в полость желудочка мозга - интравентрикулярно, в искусственную полость (интракавитально), в нерв (в т.ч. дегенерирующий), на поверхность коры большого мозга, в церебро-спинальную жидкость, подкожно, в яичко, внутримышечно.

Виды нейротрансплантации: аллотрансплантация(пересадка между индивидуумами в пределах вида, например, от человека человеку), ксенотрансплантация (пересадка между организмами разных видов, например, от дрозофилы человеку), сочетанная (вводят несколько неодинаковых нейротрансплантатов в одну структуру мозга), множественная (вводят однотипные нейротрансплантаты в разные структуры мозга), комбинированная (вводят эмбриональную нервную ткань с ненервными клеками, например, сустентоцитами яичка, которые обеспечивают гибель Т-лимфоцитов хозяина и защищают трансплантат от отторжения).

Требования к донору (от кого пересаживать): по Международному стандарту оценки на инфицированность сыворотку крови донора исследуют на наличие антител против ВИЧ, гепатита С и В, сифилиса, проводят буккальный тест или проводят исследование соскоба цервикального канала на наличие ДНК вирусов герпеса и цитомегалии, хламидий (ПЦР).

Требования к реципиенту (кому пересаживают): преимущественно детский и молодой (юношеский) возраст.

В результате взаимодействия нейротрансплантата с мозгом реципиента активизируются компенсаторные возможности нервной ткани реципиента, запускаются новые механизмы регенерации, стимулируется реиннервация разобщённых участков мозга и происходит его интеграция с нейротрансплантатом. Фактор роста нервов (ФРН) эмбрионального мозга стимулирует дифференцировку нервных клеток нейротрансплантата и их выживаемость (используется при лечении болезни Альцгеймера). Инсулиноподобный ростовый фактор (ИПРФ) стимулирует рост и созревание нервных клеток, рост аксонов, восстановление миелиновой оболочки нервных волокон (миелинизацию). Генетически изменённые фибробласты выделяют мощный стимулятор – фактор роста фибробластов (ФРФ), который оказывает влияние на мотонейроны спинного мозга и нервные клетки мозжечка. Опиаты (эндорфин, энкефалин), нейромедиатор боли (вещество Р) также оказывают нейротрофическое действие. Эпидермальный фактор роста (ЭФР) – самый ранний стимулятор роста аксонов в эмбирональном мозге. Овариальные гормоны эстрогены оказывают влияние на синаптоархитектонику, стимулируют гиперплазию межнейрональных контактов.

Культивирование нервной ткани.

Источником стволовых клеток нервной ткани является головной мозг как сформировавшегося, так и развивающегося организма. В 1990 г австралийские биологи во главе с Перри Бартлеттом впервые предложили метод селективного выделения клоногенной культуры НСК из мозга эмбрионов и взрослых животных. С помощью бессывороточной среды, содержащей LIF, bFGF и другие кофакторы, удалось на первом этапе культивирования избавиться от более продвинутых примесных клеток. Это был решающий методический успех, поскольку смешанное культивирование НСК и дифференцированных клеток вело к быстрой гибели, либо спонтанной дифференцировке НСК. Эта группа первой описала особенности роста и дифференцировки суспензионных клонов НСК/прогениторных клеток. Через два года Reynolds и Weiss использовали близкий подход для выделения суспензионной клоногенной культуры НСК, добавляя в среду сразу два ростовых фактора (EGF, bFGF). Характеристики полученных культур, особенности роста клонов НСК в главном совпали с результатами Бартлетта. В 1994 г. Davis и Temple первыми количественно и качественно охарактеризовали клоны НСК, выделенные из мозга эмбрионов крыс. Лишь 7% клонов быстро обновлялись, продуцируя более 60 % всех клеток культуры. Около 40 % клеток в клонах составляли некоммитированные плюрипотентные клетки, которые в специальных условиях дифференцировались в нейроны, астроглию или олигодендроциты. Выращивая клетки в максимальных разведениях, удалось подсчитать примерное число клон-инициирующих клеток. Все клонобразующие клетки экспрессировали нестин - белок промежуточных филаментов нейроэпителия.

К настоящему моменту разработаны коктейли химических индукторов коммитации НСК к дифференцировке в одном направлении. В частности культуральная среда для выращивания нейронов (D-MEM/F-12) содержит инсулин, трансферрин, селенит, дексаметазон, пут-ресцин, глутамин, ФРН. Среда для выращивания клеток мозга эмбриона (D-MEM) содержит инсулин, трансферрин, дексаметазон, ФРН, витамины В1, биотин, α -токоферол, ретинол, холин, кар-нитин, линолевую и липоевую кислоты, микроэлементы.

Для культивирования нервной ткани используют:

— пластмассовую посуду одноразового применения в стерильной герметичной упаковке

— стеклянную многократного использования, требующую тщательной подготовки, стерилизации в сухожаровом шкафу (160^оС)

Для облегчения прикрепления нервных клеток поверхность посуды покрывают фибронектином.

Профессор кафедры

гистологии, эмбриологии и цитологии,

д-р мед. наук Варакута Е.Ю.