Иммунодиагностика.

Иммунодиагностика – это использование реакций иммунитета для диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний.

Реакции иммунитета – это взаимодействие антигена с продуктами иммунного ответа. В любой реакции иммунитета выделяют две фазы:

1) специфическую – обусловлена взаимодействием антигена с антителом и образованием комплекса АГ – АТ;

2) неспецифическую.

Все реакции иммунитета делятся на:

1) простые; участвуют два компонента (антиген и антитело);

2) сложные; участвуют три компонента и более (антиген, антитело, комплемент и т. д.).

В специфическую фазу происходит быстрое специфическое связывание активного центра антитела с детерминантой АГ. Неспецифическая фаза проявляется видимыми физическими явлениями (образование хлопьев, «зонтика», линии преципитации в виде помутнения).

Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы (от serum – сыворотка).

В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, реакции связывания комплемента, иммуноферментный анализ, иммунофлюоресцентный метод, иммуноблотинг.

Реакция агглютинации – РА, при которой происходит связывание антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов), она протекает при наличии электролитов.

РА используют для:

1. определения антител в сыворотке крови больного, например при бруцеллезе (реакция Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (р.Видаля), туляремии, коклюше;

2. определения возбудителя, выделенного от больного;

3. определения групп крови.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировочная

Для определения у больного антител ставят в пробирках развернутую реакцию агглютинации: к разведениям сыворотки крови больного добавляют диагностикум (взвесь убитых микробов) и через несколько часов инкубации при 37 ⁰С отмечают наиболшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентировочную реакцию агглютинации на предметном стекле. К капле диагностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1: 10 или 1: 20 добавляют чистую культуру возбудителя. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю физиологического раствора. При появлении в капле с сывороткой и микробами хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках. Одновременно учитываются контроли: сыворотка, разведенная изотоническим раствором натрия хлорида должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе равномерно мутной без осадка. В ориентировочной РА пользуются адсорбированными агглютинирующими сыворотками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использовании эритроцитов с адсорбированными на их поверхности АГ или АТ, взаимодействие которых с соответствующими АТ или АГ сыворотки крови больных вызывает склеивание и при положительных результатах происходит выпадение эритроцитов на дно полистироловой пластины в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают на дно пластины в виде «пуговки».РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней (дифтерии, дизентерии, сальмонеллеза, туляремии и др.), определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на блокаде, подавлении антигенов вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты. РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней (гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита).

Реакция преципитации – это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Различают реакцию преципитации по Асколи на определение АГ возбудителя сибирской язвы и реакцию преципитации в агаре на определение дифтерийного токсина.

Реакция связывания комплемена (РСК). Для постановки реакции связывания комплемента необходимы следующие ингридеедиенты:

1)испытуемая сыворотка (АТ);

2)антиген – убитая взвесь возбудителей того или иного заболевания;

3)комплемент;

4)гемолитическая сыворотка;

5)эритроциты барана.

РСК заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому присоединяется комплемент, т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комплимент остается свободным. РСК проводят в две фазы: 1-я фаза – инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело+ комплемент; 2-я фаза индикаторная – выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей к ним антитела. В положительной реакции из-за связывания комплемента с комплексом антиген-антитело гемолиз эритроцитов не произойдет, и они осядут на дно пробирки в виде «зонтика». В отрицательных случаях связывание комплемента с комплексом антиген-антитело не происходит, он остается свободным и присоединятся к комплексу эритроции-гемолитическая сыворотка, тем самым вызывая гемолиз эритроцитов. РСК применяют для диагностики многих инфекционных заболеваний, в частности сифилиса (р.Вассермана), сыпного тифа и др.

Реакция нейтрализации проводят путем введения смеси антиген-антитело лабораторным животным. Например, для обнаружения ботулинического токсина белым мышам подкожно или внутрибрюшинно вводят вытяжку из остатков пищи (грибы) с антитоксическими ботулиническими сыворотками типов А, В, С, Е. Сыворотки получают из крови лошадей или крупного рогатого скота гипериммунизированых ботулиническими токсинами. При отсутствии у животных повреждающего действия микроорганизмов, их токсинов (мышь осталась жива) говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса АГ-АТ.

Реакция иммунофлюоресценции РИФ (метод Кунса).

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминисцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминисцирующей сывороткой светятся в виде каймы зеленого цвета. Данный метод является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или антител.

Иммуноферментный метод (ИФА). Принцип метода следующий: на твердофазном носителе (поверхность лунок полистиролового планшета) фиксируется АГ возбудителя инфекции, антитела к которому необходимо выявить. Антиген, иммобилизованный на поверхности твердого носителя, называют иммуносорбентом. В ходе инкубации иммуносорбента с испытуемой сывороткой при наличие в ней АТ к данному АГ происходит их связывание в комплекс «антиген-антитело». Затем следует инкубация с меченными ферментом антителами к иммуноглобулинам человека (конъюгатом), в ходе которой на поверхности носителя происходит присоединение к комплексу антител, меченых ферментом (в качестве фермента чаще всего используется пероксидаза хрена). Конъюгат получают на основе поликлональных антивидовых АТ, например кроличьи АТ или моноклональных АТ, направленных против человеческих иммуноглобулинов определенного класса M, G, A. В дальнейшем при добавлении субстрата происходит его взаимодействие с ферментом, в результате чего развивается цветная реакция, интенсивность которой зависит от количества связанных сывороточных АТ. При использовании пероксидазного конъюгата в качестве субстрата применяют перекись водорода в сочетании с ортофенилдиамином. Результаты реакции оцениваются спектрофотометрически с выводом цифровых данных, что исключает субъективность оценки антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В, цитомегаловирусной инфекции, герпесной, токсоплазменной, а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ.

Иммунный блоттинг. В России в настоящее время стандартной процедурой лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции является обнаружение антител к ВИЧ с последующим подтверждением их специфичности в реакции иммунного блоттинга. Обнаружение антител к ВИЧ включает два этапа. На первом этапе проводится выявление суммарного спектра антител (ИФА), на втором этапе методом иммунного блоттинга проводится определение антител к отдельным белкам вируса, иммобилизованным на нитроцеллюлозную мембрану. Белки оболочки вируса ВИЧ1, обозначаемые как гликопротеины («gp» джи пи)с молекулярным весом, выраженным в килодальтонах: 160кд, 120кд, 41кд. У ВИЧ2 гликопротеины имеют вес 140 кд, 105кд, 36кд. Белки сердцевины (gag), обозначаемые как протеины («p» пи) у ВИЧ1 имеют молекулярный вес соответственно 55кд, 24кд, 17кд, а ВИЧ2 – 56кд, 26кд, 18кд. Результаты интерпретируются как положительные, в которых обнаруживаются антитела к 2 или 3 гликопротеинам ВИЧ. Отрицательными считаются сыворотки, в которых не обнаруживается антител ни к одному из белков.