Стадия. Получение L-сорбозы из D-сорбитола путем его глубинного аэробного окисления уксуснокислыми бактериями.

3 стадия. Получение диацетон-L-сорбозы из L-сорбозы путем ее ацетонирования.

4 стадия. Получение гидрата диацетон-2-кето-L-гулоновой кислоты путем окисления диацетон-L-сорбозы.

5 стадия. Получение L-аскорбиновой кислоты из гидрата диацетон-2-кето-L-гулоновой кислоты (деацетонирование --> этерификация --> «енолизация» --> «лактонизация»).

6 стадия. Получение медицинской аскорбиновой кислоты. Перекристаллизация технической аскорбиновой кислоты.

Выход продукта в пересчете па глюкозу составляет в целом до 54%.

20. При производстве пенициллина в начале ферментации было добавлено в питательную среду определённое количество фенилуксусной кислоты, что привело к снижению выхода целевого продукта. Какова роль фенилуксусной кислоты? Какая ошибка была допущена в этом процессе?

Биосинтез антибиотиков может стимулироваться за счет различных стрессовых воздействий (изменение температуры, рН и др.), а так же добавлением в культуральную среду некоторых веществ, которые называют предшественниками. Молекула вещества – предшественника (обычно достаточно простая по строению) может является структурным фрагментом молекулы антибиотика или быть промежуточным метаболитом в его синтезе. Установлено, что синтез этой молекулы является обычно самой медленной, лимитирующей стадией всего многостадийного синтеза молекулы антибиотика.

Например, производство бензилпенициллина в значительной степени стимулируется добавками фенилуксусной кислоты, которая является структурным фрагментом молекулы бензилпенициллина; пропионовая кислота и пропиловый спирт инициируют биосинтез макролидов через метил-малонил-КоА; L-фенилаланин - ускоряет образование грамицидина S.

Молекулы предшественника (например, фенилуксусной кислоты) необходимо добавлять в среду культивирования в период завершения фазы роста культуры микроорганизма – продуцента бензилпенициллина (на 2-3 сутки для 5-суточного процесса). Добавление фенилуксусной кислоты в первые 2-3 суток после начала ферментации бессмысленно, так как на этом этапе биосинтез антибиотика не происходит.

21. Существует понятие классического скрининга антимикробных средств и таргетного скрининга. Укажите в чём их отличия?

Традиционно первичный отбор антимикробных веществ (классический скрининг) проводится путем испытания их действия на рост тест-культуры микроорганизма. Высокоактивные, подавляющие рост вещества, отобранные на этом этапе, проходят дальнейшие испытания, в частности определяется антимикробный спектр их действия и активность в опытах in vivo на лабораторных животных, а также токсичность как для макроорганизма в целом, так и для отдельных его органов и тканей. По завершении доклинических испытаний в случае получения положительных результатов препарат передается в клинику. Затем начинается углубленное изучения механизма действия антимикробного агента на субклеточном молекулярном уровнях, то есть ведется поиск его внутриклеточной мишени – макромолекулы или макромолекулярного комплекса – таргета (англ. Target – мишень) по недавно принятой терминологии. Далее выявляется ген, который кодирует образование этой макромолекулы, или гены, кодирующие образование макромолекул, входящих в макромолекулярный комплекс.

По новой технологии скрининга (таргетный скрининг) используют информацию о полностью секвенированном геноме патогена и наличии в нем «существенных» генов и генов вирулентности. В лабораториях, в которых ведется создание новых лекарств, из нескольких сотен или даже тысяч генов предварительно выбирается ген, кодирующий белок который далее будет использован, как таргет. Затем проводятся процедуры валидации мишени, установления их пространственной структуры, далее на основе полученной информации о строении активного центра мишени проводится виртуальный скрининг потенциальных антимикробных веществ (молекулярный докинг). Отобранные методом докинга соединения затем проверяют на модельных микроорганизмах.

22. Генная инженерия позволила решить проблему получения инсулина человека. Какие микроорганизмы используются в качестве продуцентов? Почему невозможно прямое получение инсулина? Почему ферментационные среды должны содержать лактозу и галактозу? Какой критерий является определяющим при оценке качества генноинженерного инсулина?

Инсулин - гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний - сахарному диабету, который как причина смерти стоит на третьем месте после сердечно-сосудистых заболеваний и рака. Инсулин - небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей (А и В), связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде одноцепочечного предшественника проинсулина состоящего из 86 аминокислотных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены С-пептидом, обеспечивающим им необходимую пространственную ориентацию при замыкании дисульфидных связей. После протеолитического отщепления С-пептида образуется инсулин. Инсулин человека невозможно получать от доноров. Не удалось, и осуществить его получение путем культивирования клеток поджелудочной железы человека. Первоначально больным вводили инсулин, полученный от домашних животных (корова, свинья). Такой инсулин обладал сильной аллергенностью из-за различия в аминокислотном составе. Затем были разработаны методы химической и биохимической трансформации свинного инсулина в человеческий. Для получения генно-инженерного инсулина используют культуру генетически модифицированных бактерий E. Coli. Поскольку бактерии не могут осуществлять посттрансляционные изменения белков человека (соединение А и ВВ цепей), то в клетках происходит биосинтез проинсулина, который далее после выделения превращают в инсулин с помощью химических или ферментативных методов. Поскольку проинсулин синтезируется в бактериальных клетках в виде химерного белка, то важнейшей задачей является тщательная очистка готового препарата инсулина от остатков бактериальных белков. Поэтому важнейшим критерием качества генно-инженерного инсулина является его пирогенность (аллергенность). Ген кодирущий синтез проинсулина ставится под контроль регулируемого лактозного промотора, поэтому добавление лактозы в среду, или переход бактерий на ее утилизацию после использования легкоусваиваемых углеводов, является сигналом к началу синтеза проинсулина.

23. Что называют пептидомиметиком?

Одним из перспективных направлений в создании новых типов лекарственных препаратов является использование соединений, называемых „пептидомиметиками“. Прямой перевод этого термина с латыни на русский означает «имитирующий, подражающий пептиду».

Многие из ферментных субстратов, например ангиотензиноген, ангиотензин, фибриноген (как предшественник фибрина), белки вируса иммунодефицита GAG и GAG-POL (предшественники протеазы и других белков ВИЧ) и многие лиганды ферментов и рецепторов, такие как серпины, энкефалины, нейрокинины, соматостатин, фибриноген, витронектин и другие, являются либо низкомолекулярными пептидами, либо белками. Взаимодействие этих лигандов с их биомишенями осуществляется, как правило, с помощью небольшого концевого участка полипептидной цепи, содержащего всего несколько аминокислот («рабочая часть ключа»), а остальная часть полипептида или белка стабилизирует определенное пространственное расположение данной части макромолекулы (“рукоятка ключа”). Показательным примером этого может служить пептидный мотив RGD (аргинин, глицин, аспартат), который взаимодействует с различными интегриновыми рецепторами в совершенно разных конформациях.

Если создаваемое нами лекарство должно подействовать на мишень, природный лиганд для которой такой пептид, то этот пептид можно взять в качестве соединения-лидера. Однако пептиды в качестве лекарств не слишком удобны: плохо растворяются в воде, легко расщепляются протеолитическими ферментами организма.

Поэтому на основе такого пептида создается лекарство- пептидомиметик - соединение, способное взаимодействовать с той же мишенью, но содержащее различные непептидные (неприродные) структурные элементы. Пептидомиметики способны копировать или противодействовать биологической активности природных белковых молекул, аналогами которых они являются..

По своей структуре пептидомиметики могут представлять собой полипептидную цепочку, построенную из молекул неприродных α -аминокислот или D-изомеров природных, часто замещенных по атому азота. Введение таких аминокислот (особенно α, α -дизамещенных) в ключевые позиции биологически активных пептидов, как правило, приводит к существенному повышению протеолитической и конформационной стабильности, селективности действия и улучшению фармакокинетических параметров потенциальных лекарств.

В принципе, пептидомиметики вовсе не обязательно должны иметь классическую полипептидную структуру. Главное, чтобы они могли эффективно имитировать полипептидный лиганд и обладать высоким сродством к биомишени. Поэтому в структуры пептидомиметиков часто вводят различные фрагменты - заместители и функциональные группы никогда не встречающиеся в природных полипептидах, которые являются биоизостерическими аналогами определенных участков природных пептидов.

Результатом успешного применения пептидомиметического подхода являются используемые в клинической практике анти - ВИЧ препараты нелфинавир, ампренавир, а так же бензодиазепиновые препараты.

24. Что представляет собой рекомбинантная молекула ДНК. Какова роль ДНК-вектора в генной инженерии?

В первой половине 70-х годов ХХ в. развитие молекулярной биологии привело к возникновению новой экспериментальной технологии, которая получила в СССР название “генная инженерия”, а в западной литературе именуется “работой с рекомбинантными молекулами ДНК”.

Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой два компонента, соединенные в бесклеточной системе: вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой («чужеродной ») ДНК, содержащий интересующие исследователя генетические элементы, которые нужно перенести в реципиентную клетку (клетка-хозяин). Сущность генетической инженерии сводится к целенаправленному конструированию искусственных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентного организма и, кроме того, они привносят в него новые генетические и физиолого-биохимические свойства, полезные для человека. К числу таких свойств можно отнести синтез аминокислот и белков, гормонов, ферментов, витаминов и др. Источником генетического материала могут выступать различные организмы не способные в обычных, природных условия, к обмену генетической информацией с организмами - реципиентами.

В настоящее время не существует единого, универсального набора методик, но чаще всего эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме:

1. Из организма - донора нужных генов - экстрагируют нативную ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК), подвергают ее избирательному ферментативному гидролизу по определенным участкам (расщепляют, разрезают) с помощью соответствующих рестриктаз и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирующий вектор) с образованием новой, рекомбинантной молекулы (конструкция «клонирующий вектор - встроенная ДНК»).

2. Эту конструкцию вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией.

3. Идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки).

4. Получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.

25. Бактериофаги. Как бактериофаги используют в генной инженерии и медицине?

Бактериофа́ ги или фа́ ги (от др.-греч. φ ᾰ γ ω - «пожираю») - вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего бактериофаги размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис. Как правило, бактериофаг состоит из белковой оболочки и генетического материала одноцепочечной или двуцепочечной нуклеиновой кислоты (ДНК или, реже, РНК). В природных условиях фаги встречаются в тех местах, где есть чувствительные к ним бактерии. Чем богаче тот или иной субстрат (почва, выделения человека и животных, вода и т. д.) микроорганизмами, тем в большем количестве в нём встречаются соответствующие фаги. Бактериофаги выполняют важную роль в контроле численности микробных популяций, в автолизе стареющих клеток, в переносе бактериальных генов, выступая в качестве векторных «систем».

Бактериофаги представляют собой один из основных подвижных генетических элементов. Посредством трансдукции они привносят в бактериальный геном новые гены. Было подсчитано, что за 1 секунду могут быть инфицированы 10²⁴ бактерий. Это означает, что постоянный перенос генетического материала распределяется между бактериями, обитающими в сходных условиях.

Фаги, как и все вирусы, являются абсолютными внутриклеточными паразитами. Хотя они переносят всю информацию для запуска собственной репродукции в соответствующем хозяине, у них отсутствуют механизмы для выработки энергии и рибосомы для синтеза белка. Умеренные и вирулентные бактериофаги на начальных этапах взаимодействия с бактериальной клеткой имеют одинаковый цикл.

· Адсорбция бактериофага на фагоспецифических рецепторах клетки.

· Инъекция фаговой нуклеиновой кислоты в клетку хозяина.

· Встраивание

· Совместная репликация фаговой и бактериальной нуклеиновой кислоты.

· Далее бактериофаг может развиваться по двум моделям: лизогенный (умеренные фаги) либо литический путь.

Одной из областей использования бактериофагов является антибактериальная терапия, альтернативная приёму антибиотиков. Например, применяются бактериофаги: стрептококковый, стафилококковый, клебсиеллёзный, дизентерийный поливалентный, пиобактериофаг, коли, протейный и колипротейный и другие. В настоящее время их применяют для лечения бактериальных инфекций, которые не чувствительны к традиционному лечению антибиотиками. Обычно, применение бактериофагов сопровождается большим, чем антибиотики, успехом там, где у бактериальных клеток присутствуют биологические мембраны, покрытые полисахаридами, через которые антибиотики обычно не проникают. В многолетнем опыте в объёме крупного города и сельской местности доказана необычайно высокая лечебная и профилактическая эффективность дизентерийного бактериофага.

Бактериофаги применяются в генной инженерии в качестве векторов, переносящих участки ДНК, возможна также естественная передача генов между бактериями посредством некоторых фагов (трансдукция).

26. Что такое гены вирулентности? Как гены вирулентности патогенных микроорганизмов используются в диагностике и разработке лекарственных препаратов?

Все гены, составляющие геном патогенных микроорганизмов, как стало ясно относительно недавно, можно разделить на две группы. Первая группа генов объединяется под названием «house keeping genes» (гены, на которых держится «дом», т.е. клетка; они всегда жизненно необходимы для ее существования, т.к. контролируют основные метаболитические процессы). Их еще называют существенные гены. Вторая, менее изученная группа, получившая условное название «гены вирулентности», существенна для сохранения жизнеспособности патогенных микроорганизмов только в условиях инфицированного организма.Кроме генов, непосредственно обусловливающих образование адгезинов и инвазинов, что способствует колонизации бактериальным патогеном животных тканей, в эту группу входят и гены, обязательные для выживания патогена в условиях воздействия на него факторов иммунитета (гены, отвечающие за выработку токсинов), гены, позволяющие микроорганизму преодолевать дефицит некоторых метаболитов и неорганических ионов (например, пуринов и железа) в организме человека, а также гены, кодирующие некоторые регуляторные системы. И те, и другие гены могут быть потенциальными биомишенями для действия лекарственных препаратов.

В принципе любые «house keeping» гены могут являться мишенями для действия антибактериальных препаратов, однако здесь имеется целый ряд существенных ограничений обусловленных общностью многих метаболитических процессов в клетках человека и бактерий.

Более перспективными биомишенями для химиотерапевтических агентов и диагностических средств являются гены вирулентности. Это обусловлено тем, что гены вирулентности специфичны у каждого микроорганизма. Поэтому диагноз будет однозначным, а лекарство-ингибитор гена вирулентности не найдет похожую мишень в организме человека. Подавление генов вирулентности не вызывает прекращения роста патогенных микроорганизмов in vitro, поскольку в этом случае гены вирулентности им не нужны. Однако в условиях in vivo значение генов вирулентности для патогена сравнивается со значением «house keeping genes», и их подавление будет приводить к антимикробному эффекту, поскольку патогенные клетки, потерявшие вирулентность, будет быстро уничтожаться защитными силами организма.

Ингибиторы генов вирулентности оказываются особенно ценными лекарственными веществами. Во-первых, к ним гораздо медленнее, чем к ингибиторам образования, например, клеточной стенки (пенициллины, цефалоспорины) или белка (стрептомицин, тетрациклины, эритромицин и др.), должна развиваться резистентность. Они не будут факторами селекции и распространения резистентных форм бактерий. Во-вторых, гены вирулентности высоко специфичны для каждого патогена: близких к ним генов в клетках организма человека нет. Это значит, что ингибиторы, отобранные по действию на гены вирулентности, более безопасны для человека, чем отобранные по другим тестам.

27. Что представляет собой гибридомная технология в получении моноклональных антител?

При введении антигена в организм возникает большое семейство антител, направленных к разным его детерминантам и различающихся даже внутри группы антител, направленных к одной и той же детерминанте. Однако иногда требуется определённый вид антител, специфичных лишь к одной детерминанте антигена и имеющих одни и те же характеристики.

Моноклональные антитела -- антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы. Моноклональные антитела могут быть выработаны против почти любого природного антигена (в основном белки и полисахариды), который антитело будет специфически связывать. Они могут быть далее использованы для детекции (обнаружения) этого вещества или его очистки.

Гибридо́ ма — гибридная клеточная линия, полученная в результате слияния клеток двух видов: способных к образованию антител B-лимфоцитов, полученных из селезёнки иммунизированного животного (чаще всего мыши), и раковых клеток миеломы (злокачественные В-лимфоциты). Слияние клеток производится с помощью нарушающего мембраны агента, такого, как полиэтиленгликоль или вирус Сёндай. Поскольку раковые клетки миеломы «бессмертны», то есть способны делиться большое количество раз, после слияния и соответствующей селекции гибридома, производящая специфические моноклональные антитела против антигена может долгое время культивироваться на искусственной среде.

28. Вакцины? Основные типы вакцин? В чем заключаются достоинства и недостатки различных видов вакцин?

Вакцинация способствует формированию у реципиента иммунитета к патогенным микроорганизмам и тем самым защищает его от инфекции. В ответ на пероральное или парентеральное введение вакцины в организме хозяина вырабатываются антитела к патогенному микроорганизму, которые при последующей инфекции приводят к его инактивации (нейтрализации или гибели), блокируют его пролиферацию и не позволяют развиться заболеванию.

Эффект вакцинации открыл более 200 лет назад - в 1796 г. - врач Эдуард Дженнер. Он доказал экспериментально, что человек, перенесший коровью оспу, не очень тяжелую болезнь крупного рогатого скота, становится невосприимчивым к оспе натуральной. Натуральная оспа - высококонтагиозное заболевание с высокой смертностью; даже если больной не погибает, у него нередко возникают различные уродства, психические расстройства и слепота. Дженнер публично провел прививку коровьей оспы 8-летнему мальчику Джеймсу Фиппсу, использовав для этого экссудат из пустулы больной коровьей оспой, а затем через определенное время дважды инфицировал ребенка гноем из пустулы больного натуральной оспой. Все проявления заболевания ограничились покраснением в месте прививки, исчезнувшим через несколько дней. Вакцины такого типа получили название дженеровских. Однако такой путь вакцинации не получил большого развития. Это объясняется тем, что в природе не всегда возможно найти малопатогенный аналог болезнетворного микроорганизма, пригодный для приготовления вакцины.

Более перспективным оказался метод вакцинации, предложенный Пастером. Пастеровские вакцины получают на основе убитых (инактивированных) патогенных микроорганизмов либо живых, но не вирулентных (аттенуированных) штаммов. Для этого штамм дикого типа выращивают в культуре, очищают, а затем инактивируют (убивают) или ослабляют (аттенуируют) таким образом, чтобы он вызывал иммунный ответ, достаточно эффективный в отношении нормального вирулентного штамма.

Для иммунопрофилактики некоторых болезней, таких, например, как столбняк или дифтерия, наличие самих бактерий в вакцине необязательно. Дело в том, что главной причиной этих заболеваний являются выделяемые этими бактериями патогенные токсины. Ученые обнаружили, что эти токсины инактивируются формалином и могут затем безопасно использоваться в вакцинах. При встрече иммунной системы с вакциной, содержащей безопасный анатоксин, она вырабатывает антитела для борьбы с настоящим токсином. Такие вакцины получили название анатоксины.

Ранее такие инфекционные болезни, как туберкулез, оспа, холера, брюшной тиф, бубонная чума и полиомиелит, были настоящим бичом для человечества. С появлением вакцин, антибиотиков и внедрением мер профилактики эти эпидемические болезни удалось взять под контроль. К сожалению, против многих болезней человека и животных вакцин до сих пор не существует или они малоэффективны. Сегодня во всем мире более 2 млрд. людей страдают заболеваниями, которые можно было бы предотвратить с помощью вакцинации. Вакцины могут оказаться полезными и для профилактики постоянно появляющихся «новых» болезней (например, СПИДа).

Несмотря на значительные успехи в создании вакцин против таких заболеваний, как краснуха, дифтерия, коклюш, столбняк и полиомиелит, производство и использование классических ”пастеровских” вакцин сталкивается с целым рядом ограничений.

1. Не все патогенные микроорганизмы удается культивировать, поэтому для многих заболеваний вакцины не созданы.

2. Для получения вирусов животных и человека необходима дорого-стоящая культура животных клеток.

3. Титр вирусов животных и человека в культуре и скорость их размноже-ния часто бывают очень низкими, что удорожает производство вакцин.

4. Необходимо строго соблюдать меры предосторожности при производстве вакцин из высокопатогенных микроорганизмов, чтобы не допустить инфицирования персонала.

5. При нарушении производственного процесса в некоторые партии вакцины могут попасть живые или недостаточно ослабленные вирулентные микроорганизмы, что может привести к неумышленному распространению инфекции.

6. Аттенуированные штаммы могут ревертировать (восстанавливать свою вирулентность), поэтому необходимо постоянно контролировать их вирулентность.

7. Некоторые заболевания (например, СПИД) нельзя предупреждать с помощью традиционных вакцин.

8. Большинство современных вакцин имеют ограниченный срок годности и сохраняют активность только при пониженной температуре, что затрудняет их использование в развивающихся странах.

29. Имунные сыворотки. Сыворотки на основе поликлональных и моноклональных антител?

Иммунные сыворотки – это иммунобиологические препараты, приготовленные из сыворотки крови человека или животных (поликлональные сыворотки), или полученные методами клеточной или генетической инженерии (моноклональные), которые применяются для лечения, профилактики и диагностики инфекционных заболеваний.

Иммунобиологическую основу иммунных сывороток составляют антитела, относящиеся к гамма – глобулинам (иммуноглобулинам Ig) IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.

Существует несколько классификаций иммунных сывороток: по источникам получения – иммунные сыворотки получают от человека (гомологичные) или от животных (гетерологичные); по целям с которыми они применяются – лечебные, профилактические (или лечебно – профилактические) и диагностические; по характеру антигенов, против которых направлены антитела (антимикробные, антитоксические).

Лечебно – профилактические сыворотки получают от людей (специально многократно иммунизированные, а в некоторых случаях и обычные доноры) или от специально многократно иммунизированных лошадей. Эти сыворотки применяются с целью серопрофилактики или серотерапии.

С целью серопрофилактики иммунные сыворотки применяются если есть подозрение на проникновение возбудителя в организм (например, ребенок побывал в контакте с больным корью, или человека укусила бродячая собака и др.). Серопрофилактика может и не обеспечить полное ингибирование развития инфекции, но развившееся инфекционное заболевание будет протекать в более легкой клинической форме. Целесообразно для эффективного действия антитоксические и антимикробные иммунные сыворотки вводить в первые же дни после предполагаемого заражения (до развития патологического процесса).

С лечебной целью (серотерапия) иммунные сыворотки вводятся при наличии явных клинических признаком конкретного заболевания (столбняк, ботулизм, дифтерия, чума, газовая раневая инфекция и др.) или отравления ядами белковой природы (змеиный яд, яд насекомых).

Применение иммунных сывороток с лечебной целью позволяет облегчить клиническую тяжесть инфекционного заболевания. Более раннее введение с лечебной целью иммунных сывороток оказывает более эффективное действие.

Многократно иммунизированные лошади являются донорами иммунных сывороток, применяемых для введения людям потому, что белки сыворотки их крови по структуре очень близки к белкам крови человека.

При введении человеку сыворотки крови лошади частота аллергических осложнений значительно меньше, чем после введения сыворотки других животных (свиньи).

Диагностические иммунные сыворотки получают, иммунизируя животных (например, кроликов). Эти сыворотки используются для идентификации микробов или экзотоксинов по антигенной структуре. Иммунные диагностические сыворотки, обработанные флюорохромом, используются для экспресс – диагностики инфекционных заболеваний методом иммунной флюоресценции.

Диагностические сыворотки, как носителей белков (полноценных антигенов) резко отличающихся от человеческих, способных вызвать резкую сенсибилизацию человека с последующим развитием аллергических реакций угрожающих его жизни, вводить людям нельзя.

Основным направлением в разработке новых сывороток, в настоящее время, является создание диагностических и лечебно-профилактических сывороток на основе моноклональных антител. В диагностике это резко повышает точность и воспроизводимость анализа, в терапии заболеваний — существенно повышает активность, избирательность действия препарата, и снижает его аллергенность.

30. Что такое гумманизированные моноклональные антитела? Как гумманизированные моноклональные антитела используются в терапии онкозаболеваний?

В терапии моноклональными антителами используются антитела, которые синтезированы в лаборатории, а не собственной иммунной системой человека. Как только моноклональные антитела попадают в организм, они «побуждают» другие компоненты иммунной системы к уничтожению целевых антигенов, таких, как, например, раковые клетки.

Первые моноклональные антитела, синтезированные в лабораторных условиях, полностью состояли из белков мыши. Проблема состояла в том, что иммунная система человека распознавала эти антитела как чужеродные и принимала ответные меры против них. В краткосрочной перспективе это означало стимуляцию иммунного ответа. В долгосрочной перспективе, иммунная система организма уничтожала их прежде, чем они могли оказать лечебный эффект.

Со временем, исследователи научились заменять некоторые части белков мышиных антител на белковые компоненты человека, такие антитела стали известны как химерические. Поскольку доля белковых компонентов человека, используемых в составе мышиных антител увеличивалась, то резко снизилась их аллергенность, и они получили название гуманизированных антител. Некоторые моноклональные антитела в настоящее время полностью являются белком человека, а это означает, что они, вероятно, будут еще более безопасными и могут быть более эффективными, чем ранее синтезированные моноклональные антитела.

В настоящее время разработано много онкологических препаратов основанных на использовании гумманизированных антител. Одни из них представляют собой набор чистых антител к опухолевым белкам, другие — коньюгаты антител с антибиотиками, и радиоактивными изотопами.

31. Что такое фармакогеномика? Как достижения фармакогеномики используются в разработке новых лекарственных препаратов?

Фармакогеномика — отрасль фармацевтики и фармакологии, которая исследует влияние генетической вариации каждого человека в его ответе на лекарственное средство. Фармакогеномика связывает экспрессию конкретного гена или однонуклеотидного полиморфизма в геноме человека с эффективностью или токсичностью лекарства, для того, чтобы разработать рациональные средства оптимизации фармакотерапии. Фармакогеномика учитывает генотипы людей для обеспечения максимальной эффективности при минимальных побочных действиях. Подобный подход в будущем может привести к созданию «персонифицированной медицины», в которой лекарственные средства и их сочетания будут оптимизированы для генетических характеристик конкретного человека. Фармакогеномика — это прикладное применение исследования генома человека, в котором фармакогенетика исследует взаимодействия отдельного гена с лекарствами.

Одной из первых областей применения фармакогенетики стала онкология.Это связано с тем, что большинство противоопухолевых препаратов являются очень токсичными, способными вызвать нежелательные эффекты. Например, тиогуанин и меркаптопурин применяются для химиотерапии острой лейкемии, а также для профилактики отторжения пересаженных органов и тканей. Фермент тиопуринметилтрансфераза (ТПМТ) в норме обезвреживает эти вещества, однако у одного из 300 человек фермент ТПМТ отсутствует, а, примерно у 10 % людей его активность снижена, что резко увеличивает токсичность препаратов. В некоторых зарубежных клиниках уже сейчас для предупреждения развития побочных эффектов проводят измерение активности ТПМТ перед назначением лечения. Если активность фермента снижена, уменьшают и дозы выбранных препаратов.

Не менее важны эти исследования в повышении эффективности клинических испытаний новых препаратов. В настоящее время, чтобы клинические испытания статистически значимо подтверждали безопасность и эффективность препарата, его необходимо в течение длительного времени проверять на больших по численности группах добровольцев, что очень дорого. Если на любой стадии испытания у препарата выявляются нежелательные побочные эффекты, то он может быть снят с дальнейших испытаний.

Поэтому, если у какой-либо фармкомпании имеется доведенное до стадии клинических испытаний лекарство, которое на первом этапе вызывает побочные эффекты у определенного числа пациентов-добровольцев, то в дальнейшем этих людей будут тестировать, чтобы определить, не являются ли эти эффекты генетически обусловленными. Если это подтвердится, то люди входящие в такие генетически однородные группы будут отстранены от дальнейших этапов клинических исследований и относительно них будут даны специальные рекомендации в документах по применению данного фармпрепарата. Это позволит более быстро получить одобрение на применение препарата у тех больных, которым он не окажет вреда и будет терапевтически эффективным. А с коммерческой точки зрения, отбор добровольцев с учетом их генетических вариаций, позволит фармкомпании сэкономить миллиарды долларов, которые тратятся сейчас на неэффективные испытания или на лечение побочных эффектов. Кроме того, для целого ряда жизненно важных медикаментов, не получивших одобрения по причине высокого риска осложнений, это может означать возвращение на рынок, правда, при условии, что будут проведены фармакогеномные исследования для определения групп больных, которые получат наибольшую пользу от их применения.

32. Биополимеры. Основные требования к биополимерам. Что такое “умные биополимеры”?

За последние годы все возрастающее значение для медицины и биотехнологии приобретают «умные» полимеры. Так называют полимеры, способные реагировать (сжиматься или набухать) на небольшие изменения во внешней среде (температура, рН, электрическое поле и т.д.). «Умные» полимеры с иммобилизованными БАВ используются для выделения лекарств при определенных условиях, как правило, при заданной температуре или рН. Среди «умных» полимеров наибольшее число публикаций посвящено поли(N-изопропилакриламиду) (поли-N-ИПАА). Данный полимер имеет в воде нижнюю критическую температуру растворения (НКТР) ~32°С, т.е. близкую к температуре человеческого тела. Выше 32°С происходит фазовое разделение, обусловленное конформационным переходом макромолекулы поли-N-ИПАА из рыхлой глобулы в компактный клубок, что сопровождается резким уменьшением размеров макромолекулы. Было изучено поведение гидрогелей, полученных на основе поли(N-изопропилакриламида) и скорость диффузии иммобилизованных в них лекарственных препаратов в условиях имитирующих человеческий организм. Было установлено, что при 37⁰С и рН=1, 4 (нормальные условия в желудке человека) происходит медленное выделение иммобилизованных в гидрогель индометацина и амилазы, но при изменении величины рН до 7, 4 (условия в кишечнике) выделение лекарств значительно ускоряется. Таким образом, можно создавать лекарственные формы, позволяющие доставлять препарат к пораженному органу без значительных потерь.

Другим направлением использования таких “умных” полимеров является создание сигнал-чувствительных систем, состоящих из биосенсора, активатора и резервуара для коррекции нарушений в работе различных органов в организме человека. Так для больных диабетом разрабатываются специальные системы с биосенсором на глюкозу, которые запускаются по принципу включение - выключение для выделения определенных порций инсулина, иммобилизованного в гелях, т.е. работающие по принципу поджелудочной железы.

33. Расскажите об основных методах концентрирования, выделения и сушки лекарственных препаратов белковой природы?

Получение продуктов белковой природы является весьма трудоемким и ответственным процессом. Это обусловлено тем, что белки являются лабильными соединениями весьма чувствительными к таким факторам как высокая температура, рН, наличие в растворе различных ионов. В процессе выделения и очистки они легко подвергаются необратимой денатурации, связанной с разрушением пространственной структуры молекулы, и теряют свою биологическую активность. Поэтому в процессе получения белков медицинского назначения и ферментов приходится использовать различные мягкие методы, позволяющие избежать потери активности. Например, для концентрирования разбавленных растворов белков используют методы вакуум-выпаривания или вымораживания раствора, ультрафильтрацию в режиме диализа. Для выделения белков из растворов используют мягкие высаждающие реагенты (хлориды и сульфаты щелочных металлов, этанол, ацетон), частично разрушающие гидратную оболочку белковой молекулы, но не затрагивающие ее структуру (обратимая денатурация). Для мягкого удаления влаги из белковых осадков используют вакуум-выпаривание и лиофильную сушку.

34. Что такое метаболитическая перегрузка? Использование регулируемых промоторов для предотвращения метаболитической перегрузки?

Метаболитическая перегрузка – явление, возникающее при культивировании сверхпродуцентов, несущих рекомбинантные молекулы ДНК с чужеродными генами. Экспрессия таких чужеродных генов не нужна клеткам, однако они вынуждены осуществлять ее. В результате этого в таких клетках возникает дефицит различных метаболитов (аминокислот, карнбоновых кислот, сахаров), молекул АТФ и кислорода. Это существенно нарушает нормальный клеточный метаболизм, что в первую очередь сказывается на скорости размножения таких клеток и их продукционной способности. В результате снижается синтез целевого продукта, ухудшается его качество (например, при дефиците аминокислот резко увеличивается число ошибок в процессе трансляции). В результате отрицательного естественного отбора такие клетки через несколько циклов деления могут потерять свои рекомбинантные плазмиды. Для снижения метаболитической перегрузки и предотвращения потери рекомбинантных плазмид, используются различные методы. Одним из самых эффективных и удобных является метод, основанный на использовании регулируемых промоторов. Такие промоторы обеспечивают экспрессию чужеродных генов не всегда, а только в определенное, наиболее благоприятное время. На начальных этапах культивирования такие промоторы репресированы, чужеродный ген заблокирован, метаболитической перегрузки нет, и клетки могут интенсивно размножаться, увеличивая свою биомассу в ферментере. При достижении заданной концентрации клеток в культуральную среду вводят вещества — индукторы (лактозу, триптофан) или меняют условия культивирования (температуру). Промоторы активируются, и начинается экспрессия чужеродного гена.

35. Что такое химерные белки? Почему процессы получения рекомбинантных белков человека включают стадию получения химерного белка?

Очень часто, даже после успешного клонирования и подбора эффективных условий для экспрессии, чужеродные белки, особенно небольшие, обнаруживаются в клетках лишь в минимальных количествах. Такой кажущийся низкий уровень экспрессии кодирующих их генов во многих случаях объясняется быстрой деградацией этих чужеродных белков в хозяйских клетках. Один из способов решения этой проблемы состоит в ковалентном присоединении продукта клонированного гена к какому-нибудь стабильному белку клетки-хозяина. В составе подобной конструкции, получившей название «химерный белок», продукт клонированного гена оказывается защищенным от расщепления протеазами хозяйской клетки, что было показано в ходе экспериментов. Слияние белков программируется на уровне ДНК лигированием кодирующих участков соответствующих генов. Большинство видоспецифичных белков человека получают микробиологическим синтезом в виде различных химерных белков. Далее химерные белки выделяют и расщепляют на бактериальный и человеческий. Далее проводят тщательную очистку белков человека от остатков бактериальных белков, т. к. их наличие в лекарственном препарате может вызвать аллергическую реакцию у пациента.

36. Что такое направленный мутагенез и в чем заключается его принципиальное отличие от индуцированного мутагенеза?

Классические методы селекции и мутагенеза обычно используют для усиления и закрепления полезных свойств, возникших у организма в результате спонтанных мутаций. Для получения белков-ферментов с заранее заданными свойствами эти методы малопригодны. Это обусловлено тем, что число мутантных белков, образующихся в результате замены отдельных нуклеотидов в структурном гене с помощью обычного, классического мутагенеза, чрезвычайно велико. Даже мутагенез с последующим отбором редко приводит к существенному улучшению свойств исходного белка, поскольку большинство аминокислотных замен (мутаций) неблагоприятны и сопровождаются снижением активности фермента.

Для создания белков со специфическими свойствами можно использовать другой подход, основанный на целенаправленном внесении изменений в кодирующие их гены с помощью методов генетической инженерии (направленный мутагенез). При этом, когда говорят о направленном мутагенезе, то имеют в виду незначительные изменения (замены одной или нескольких аминокислот) в белковой молекуле. Чтобы такие замены приводили к желаемому результату, предварительно проводят компьютерное моделирование взаимодействия белка с лигандом или субстратом. Виртуально заменяя отдельные аминокислоты стараются добиться большей эффективности такого взаимодействия. Затем варианты замен, дающие наилучший эффект проверяют экспериментально, получая такой белок и вводя его во взаимодействие с целевым лигандом и субстратом. Это позволяет значительно быстрее получать белки с более лучшими, чем у их природных аналогов, свойствами.

37. Расскажите об основных методах мутагенеза и селекции в получении сверхпродуцентов?

Любые продукты биосинтеза для того, чтобы стать “объектом" рентабельного промышленного производства, должны выделяться клеткой в питательную среду и накапливаться в среде в количествах, которые оправдывали бы сырьевые и энергетические затраты на культивирование продуцента и выделение продукта в необходимой для дальнейшего использования форме. Постоянное повышение уровня продукции того или иного вещества у микроорганизма - это наиболее эффективный способ интенсификации биотехнологического производства, не требующий значительных дополнительных капиталовложений в оборудование. На протяжении всей истории человечества, основным путем повышения продуктивности используемых человеком живых организмов, как высших многоклеточных (животные и растения) так и микроорганизмов является селекция, т.е. целенаправленный отбор организмов со скачкообразным изменением полезных для человека свойств.

В настоящее время сформировалось четыре основных подхода, используемых в селекционной работе:

1. отбор штаммов, обладающих ценными признаками, проявляющимися в конкретных условиях их существования и благоприятствующими выживанию (синтез антибиотика, способность к более быстрому усвоению того или иного питательного вещества); при размножении такой культуры (с учетом частоты спонтанных мутаций) наступает популяционное давление, когда наиболее приспособленная мутантная форма вытесняет исходную в популяции. Этот подход опирается на естественный ход событий у микроорганизмов в измененных условиях (естественный отбор);

2. искусственный отбор клонов микроорганизмов с полезными для человека признаками, возникшими на основе естественной изменчивости родительских форм. К такому отбору прибегают тогда, когда контролируемый признак биологически малоценен для микроорганизма и поэтому трудно создать условия выращивания культуры, в которых относительно легко удавалось бы выделять штаммы с нужными признаками в естественных условиях.

Эти методы селекции основываются на использовании спонтанных скачкообразных наследственных изменений генов - мутаций, вызванных процессами рекомбинации генетического материала in vivo. Процессы слепого многоступенчатого отбора случайных мутаций чрезвычайно длительны и могут занимать целые годы. Это обусловлено тем, что для возникновения мутаций интересующий ген должен реплицироваться 10^{6 -} 10⁸ раз, однако это вовсе не означает, что любой получившийся мутант будет обладать полезными свойствами. Большинство мутаций неблагоприятны для организма, часто летальны, и лишь ничтожная часть их может способствовать выживанию или повышению выхода целевого продукта. Поэтому методы селекции, основанные на отборе естественно возникающих мутантов являются очень длительными, непредсказуемыми и применимы только к организмам с коротким временем жизни и высокой частотой смены поколений (микроорганизмы).

Более эффективен метод искусственного изменения генома, что резко, на много порядков увеличивает частоту мутаций. Таким методом является индуцированный мутагенез, основанный на использовании мутагенного действия ряда химических соединений (гидроксиламин, нитрозамины, азотистая кислота, бромурацил, 2-аминопурин, алкилирующие агенты, антибиотики и др.), нейтронных, γ -, рентгеновских и ультрафиолетовых лучей, ультразвука, температуры, биологических мутагенов (фаги, вирусы, биотоксины). Мутагены вызывают замены и делеции (удаления) оснований в составе ДНК, а также индуцируют мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания информации. По механизму действия все мутагены можно разделить на две группы:

а. Мутагены прямого действия, непосредственно воздействующие на ДНК;

б. Мутагены непрямого действия. Такие мутагены непосредственно на ДНК не действуют, однако они вызывают образование других веществ, которые и вызывают мутации. Например, различные виды ионизирующего излучения вызывают образование в клетках пероксидных радикалов, которые в свою очередь повреждают ДНК. Мутагены непрямого действия могут так же повреждать различные специфические белки-ферменты участвующие в процессах репликации и транскрипции гена.

3. Эффективной технологией, позволяющей совместить возможности различных видов мутагенеза и искусственого отбора форм является ступенчатая селекция. Сущность метода состоит в том, что исходную культуру клеток, у которых интересующий человека признак развит в очень незначительной степени, обрабатывают мутагенами различной природы, что обычно вызывает резкое увеличение частоты различных мутаций. Далее среди образовавшихся мутантных форм проводят поиск (скрининг) таких, у которых интересующий полезный признак усилился. Эти клетки отбирают и получают на их основе чистую культуру, которую опять подвергают воздействию мутагенных факторов различной природы. Далее опять проводят отбор наиболее эффективных мутантов. Процедуры мутагенеза и скрининга повторяют необходимое количество раз, добиваясь существенного возрастания контролируемого показателя (активность, продуктивность и др.).

Искусственное, целенаправленное конструирование геномов с использованием методов клеточной (соматическа, парасексуальная гибридизация, гибридомная гехнология) и генной инженерии (рекомбинантные молекулы ДНК, направленный мутагенез).

38. В чем заключается метод иммуноферментной диагностики на основе моноклональных антител? Основные достоинства и недостатки метода.

Важнейшей предпосылкой успешного лечения заболевания любой природы является его ранняя диагностика. Одним из наиболее широко применимым методом ранней диагностики является иммуноферментный анализ (ИФА) и прежде всего его разновидность- ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA). Процедура его проведения включает следующие этапы:

1. У человека с подозрение на определенное заболевание берется кровь из вены. Задачей анализа является обнаружение в крови специфических антигенов, в роли которых обычно выступают антитела, вырабатываемые имунной системой в ответ на инфекцию (на наличие антигенных белков) или определенный воспалительный или патологический процесс. О степени протекания процесса судят по количеству определяемых антител в пробе.

2. Анализ проводится на специальной планшетке содержащей несколько десятков микроскопических лунок в каждую из которых добавляются анализируемые пробы. На поверхности каждой лунки иммобилизованы (прикреплены) антитела, специфичные к анализируемому антигену. Если в анализируемой пробе присутствуют молекулы антигена, то они связываются с прикрепленными к поверхности лунки антителами. Затем лунки промывают с целью удаления не связавшихся молекул антигена.

3. На следующем этапе в лунки добавляют раствор антител, специфичных к искомому антигену. Особенностью этих антител является то, что они представляют собой коньюгат (комплекс) с ферментом, катализирующим определенную цветную реакцию, или с определенной хромофорной группой, дающей свечение (люминесценцию) при облучении пробы ультрафиолетовыми лучами. Затем лунки опять промывают с целью удаления не связавшихся молекул антигена.

4. Далее в лунки добавляется бесцветный реагент, который под действием конъюгированного с антителом фермента приобретает цветную окраску. По интенсивности окраски, методом фотокалориметрии, оценивают количество антигена и степень развития болезни.

Благодаря целому ряду несомненных преимуществ: удобства в работе, быстроты, объективности за счёт автоматизации учёта результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время иммуноферментный анализ является одним из основных методов лабораторной диагностики.

Однако у этого метода есть свои недостатки. ИФА обладает определенной инерционностью и может давать какложноположительные так и ложноотрицательные результаты.

Например, ложноположительные результаты при определении инфекций могут быть обусловлены наличием в крови антител, образовавшихся в результате ранее уже перенесенной болезни (диагностика малярии, гепатита), или в результате ранее проведенной вакцинации.

Ложноотрицательные результаты при определении антител могут быть обусловлены нарушениями имунной системы, а также техническими ошибками при постановке анализа. Даже у человека с нормальной имунной системой имеется так называемое «cеронегативное окно» - промежуток времени от инфицирования до отклика имунной системы в виде выработки заметных количеств антитет. Этот промежуток времени в зависимости от типа инфекции может занимать от нескольких дней до нескольких недель. Поэтому метод не позволяет диагностировать инфекцию на самых ранних стадиях.

39. Как методы генной инженерии используются в создании новых видов вакцин?

Основные подходы к созданию вакцин нового типа на основе методов генной инженерии заключаются в следующем:

1. Модификация генома патогенного микроорганизма. Работы в этой области ведутся по двум основным направлениям:

А) Патогенный микроорганизм модифицируют, делетируя (удаляя) из его генома гены, ответственные за вирулентность (гены кодирующие синтез бактериальных токсинов). Способность вызывать иммунный ответ при этом сохраняется. Такой микроорганизм можно безбоязненно использовать в качестве живой вакцины, поскольку выращивание в чистой культуре исключает возможность спонтанного восстановления удаленного гена.

Б) Другой способ получения непатогенных штаммов, пригодных для создания на их основе живых вакцин, состоит в удалении из генома патогенных бактерий хромосомных областей, отвечающих за некоторые независимые жизненно важные функции (метаболитические процессы), например синтез определенных азотистых оснований или витаминов. При этом лучше делетировать, по крайней мере, две такие области, поскольку вероятность их одновременного восстановления очень мала. Предполагается, что штамм с двойной делецией будет обладать ограниченной пролиферативной способностью (ограниченным сроком жизни в иммунизируемом организме) и сниженной патогенностью, но обеспечит выработку иммунного ответа.

2. Использование непатогенных микроорганизмов с встроенными в клеточную стенку специфическими имуногенными белками. С помощью методов генной инженерии создают живые непатогенные системы переноса отдельных антигенных участков (эпитопов) или целых имуногенных белков неродственного патогенного организма. Один из подходов, используемых при создании таких вакцин, состоит в размещении белка - антигена патогенной бактерии на поверхности живой непатогенной бактерии, так как в этом случае он обладает более высокой иммуногенностью, чем когда он локализован в цитоплазме. Многие бактерии имеют жгутики, состоящие из белка флагеллина; под микроскопом они выглядят как нити, отходящие от бактериальной клетки. Если сделать так, что жгутики непатогенного микроорганизма будут нести специфический эпитоп (белковую молекулу) патогенного микроорганизма, то можно будет индуцировать выработку защитных антител. Вакцина, созданная на основе таких рекомбинантных непатогенных микроорганизмов, будет способствовать развитию выраженного иммунного ответа на патогенный микроорганизм.

3. Создание субъединичных (пептидных) вакцин. Если какие то патогенные микроорганизмы не растут в культуре, то на их основе не возможно создать классическую пастеровскую вакцину. Однако, можно выделить, клонировать и экспрессировать в альтернативном непатогенном хозяине (например, в Е. coli или линии клеток млекопитающих) гены, отвечающие за выработку тех или иных антигенных белков, а затем выделить и использовать эти белки после очистки как «субъединичные» вакцины.

4. Создание “векторных вакцин”. Эти вакцины принципиально отличаются от вакцин других типов тем, что имуногенные белки не вводятся в готовом виде в имунизируемый организм с компонентами вакцины (клетки микроорганизмов и продукты их разрушения), а синтезируются в непосредственно в нем, за счет экспрессии кодирующих их генов, которые в свою очередь переносятся в имунизируемый организм с помощью специальных векторов. Наиболее широко “векторные вакцины” создаются на основе вируса коровьей оспы (ВКО), а так же ряда других условно- или малопатогенных вирусов (аденовирус, полиовирус, вирус ветряной оспы).

ВКО имеет широкий спектр хозяев (позвоночных и беспозвоночных), остается жизнеспособным в течение многих лет после лиофилизации (испарения воды с помощью замораживания) и не обладает онкогенными свойствами, а потому весьма удобен для создания векторных вакцин.

Векторные ВКО-вакцины позволяют провести иммунизацию сразу от нескольких заболеваний. Для этого можно использовать рекомбинантный ВКО, который несет несколько генов, кодирующих разные антигены.

Живая рекомбинантная векторная вакцина имеет ряд преимуществ перед неживыми вирусными и субъединичными вакцинами:

1) образование и активность аутентичного антигена практически не отличается от такового при обычной инфекции;

2) вирус может реплицироваться в клетке-хозяине и увеличивать количество антигена, который активирует продукцию антител В-клетками (гуморальный иммунитет) и стимулирует выработку Т-клеток (клеточный иммунитет);

3) встраивание нескольких генов антигенных белков в геном ВКО еще больше уменьшает его вирулентность.

5. «Cъедобные вакцины» Еще одним перспективным направлением в создании вакцин нового поколения является использование специально созданных трансгенных растений. Если встроить в геном вирусов этих растений гены, кодирующие синтез имуногенных белков или отдельных антигенных эпитопов различных патогенных микроорганизмов, то растения начнут их экспрессировать. После употребления в пищу таких растений в слизистой желудка и кишечника человека будут вырабатываться соответствующие антитела (так называемые мукозальные антитела). Предполагается, что такие " банановые вакцины" в недалеком будущем могут составить серьезную конкуренцию как традиционным, так и генноинженерным вакцинам.

40. Что представляют собой лекарственные препараты на основе олигонуклеотидов (“антисмысловые” РНК, рибозимы, малые интерферирующие РНК)?

Многие заболевания возникают при гиперпродукции функционального активного белка. Отсюда возникает задача подавления продукции такого белка. Для этого необходимо избирательно подавлять экспрессию гена, кодирующего этот белок, или гена-фермента, участвующего в его модификации и превращения в активную форму. Для этого предложено получать комплиментарную для участка ДНК или РНК каждого гена последовательность нуклеотидов, которая за счет водородных связей будет реагировать с ДНК гена или информационной РНК, подавляя процессы транскрипции или трансляции.

Данные инновационные ЛС получили общее название «антигенных» и «антисмысловых олигонуклеотидов». Исследования показали, что более эффективными и безопасными для человека являются «антисмысловые олигонуклеотиды». Рибозимы это природные РНК-подобные молекулы, обладающие свойствами ферментов. Рибозимы избирательно гидролизуют определенные молекулы РНК по определенным участкам, подавляя, как и «антисмысловые олигонуклеотиды», процессы трансляции. М алые интерферирующие РНК — это комплексы коротких двухцепочечных молекул РНК и ферментов хеликазы и нуклеазы. В клетках такие комплексы избирательно разрушают чужеродные, вирусные молекулы РНК.

Синтетические аналоги “антисмысловых” РНК, рибозимов, малых интерферирующих РНК могут быть использованы для терапии широкого круга заболеваний (инфекционных, воспалительных, онкологических). Чтобы создать на их основе лекарств, необходимо повысить их способность к проникновению в различные клетки и органы человека, их устойчивость к биотрансформации в организме человека и избирательность действия на определенные мишени. В настоящее время первые препараты такого типа уже проходят клинические испытания.

41. Расскажите об основных способах стерилизации питательных сред и оборудования в биотехнологических производствах?

Важнейшей предпосылкой успешного проведения промышленного биотехнологического процесса является поддержание стерильных условий в основном и вспомогательном оборудовании. Попадание посторонних микроорганизмов в установку (контаминация) может произойти с питательной средой, воздухом для дыхания, а так же за счет нарушения герметичности оборудования или его недостаточной предварительной стерилизации.

Под стерилизацией обычно понимают любой метод воздействия, обеспечивающий удаление микробов - контаминантов или их разрушение (гибель). Наиболее распространенным и универсальным среди возможных методов, вызывающих деструкцию микроорганизмов, является метод, основанный в использовании высоких температур. Клетки микроорганизмов, а так же их споры более чувствительны к тепловому воздействию, чем большинство химических веществ, используемых в питательных средах. На практике главная цель стерилизации - достижение стерильности, при сохранении качества питательной среды. Длительность экспозиции, или время выдержки - это тот временной интервал, в пределах которого погибают микроорганизмы, но сохраняется качество питательной среды. Для мягкой стерилизации жидких питательных сред используют фильтрование питательных сред через бактериальные фильтры, а для стерилизации твердых сред-рентгеновское и гамма-излучение. Стерилизацию воздуха, подаваемого в ферментер, осуществляют путем фильтрования через пористые и волокнистые материалы, а воздуха в рабочих зонах — с помощью УФ-излучения. Для стерилизации оборудования используют термическую обработку перегретым паром, или стерилизацию газообразными химическими веществами.

42. Расскажите об основных способах промышленного культивирования микроорганизмов – продуцентов лекарственных веществ.

Технология микробиологического синтеза обязательно включает в себя в качестве основной стадию промышленного культивирования соответству-ющего микроорганизма-продуцента (ферментация). В условиях промышлен-ного производства такое культивирование проводят по одному из следующих двух способов:

1. культивирование на твердых питательных средах или на поверхности тонкого слоя жидкой питательной среды (поверхностный способ выращивания продуцента). Метод неудобен для поддержания асептических условий, требует большого количества ручного труда. В настоящее время используется для получения некоторых ферментных препаратов и для культивирования растительных клеток в виде каллусных культур.

2. культивирование соответствующего продуцента в большом объеме жидкой фазы, содержащей все необходимые для нормального роста и развития микроорганизма питательные вещества (глубинный способ выращивания продуцента). Глубинное культивирование лежит в основе большинства современных биотехнологических процессов. Оно используется для осуществления аэробных и анаэробных процессов, может осуществляться в периодическом и непрерывном режиме по схеме идеального смешения и идеального вытеснения. Глубинное культивирование позволяет проводить процессы в условиях самой строгой асептики, при минимальных затратах ручного труда.

43. Расскажите, как ферменты могут быть использованы для разделения изомеров в рацемических смесях лекарственных веществ?

Оптические изомеры одного и того же химического вещества могут обладать различной, зачастую противоположной биологической активностью. Например, человек из пищи может усваивать только L-изомеры аминокислот. Известно много примеров, когда одни энантиомеры вещества-лекарства обладают нужной активностью, а другие неактивны, имеют противоположную активность или даже являются ядом (талидомид, кодеин). Разделение энантиомеров обычными химическими и физическими методами дорого, малоэффективно, а зачастую и не возможно.

В настоящее время на коммерческий уровень поставлено ферментативное разделение рацемических смесей аминокислот и эфиров терпенов. Такие смеси почти всегда образуются при химическом синтезе, и разделение энантиомеров имеет важное практическое значение. Известно, что для этого можно использовать традиционные физико-химические и химические методы (хроматография; механическое разделение, избирательное взаимодействие энантиомеров с другими оптически активными веществами), но гораздо более эффективными и удобными оказываются процессы, основанные на стереоспецифичности ферментов. Рассмотрим некоторые из используемых приемов.

1. Избирательное ацилирование аминов (например, анилина) L-аминокислотами под действием ферментов папаина, бромелина или фицина. Образующийся анилид L-аминокислоты нерастворим в воде и может быть легко отделен от непрореагировавшего растворимого D-изомера аминокислоты, а затем подвергнут гидролизу.

2. Асимметричный гидролиз сложных эфиров. В этом случае осуществляется стереоспецифический гидролиз производных аминокислот или терпенов, в результате которого образуется только один энантиомер. Эфиры L-аминокислот гидролизуют протеолитическими ферментами (химотрипсином); нужный продукт и не вступающие в реакцию D-эфиры, разделяют по растворимости.

3. Стереоспецифический гидролиз N-ацил -L-аминокислот под действием аминоацилазы или карбоксипепсидазы, приводящий к образованию L-аминокислот.

44. Для чего необходима операция наработки продуцента в промышленных биотехнологических процессах?

Современные биотехнологические процессы характеризуются использованием аппаратов – ферментеров большого объема (50-500 м³). Запуск процесса культивирования и выведение его на рабочий режим (достижение оптимальной плотности клеточной культуры) является одной из самых сложных и длительных процедур. Часто процесс приходится останавливать в самый последний момент и начинать все сначала из-за попадания в аппарат посторонней микрофлоры или потери клетками, по разным причинам, частично или полностью своих продуктивных свойств. Поэтому приготовления