Главная страница Случайная страница
КАТЕГОРИИ:
АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника
Примеры некоторых рестриктаз и их рестрикционных сайтов
|
|
| Типы рестриктаз | Рестриктаза | Сайт распознавания |
| Макрорестриктазы, распознающие последовательности из 6 и более нуклеотидов | SmaI | 5'...C C C^G G G...3' 3'...G G G^C C C...5' |
| SalI | 5'...G^T C G A C...3' 3'...C A G C T^G...5' | |
| XbaI | 5'...T^C T A G A...3' 3'...A G A T C^T...5' | |
| Стандартные рестриктазы | HaeIII (BsuRI) | 5'...G G^C C...3' 3'...C C^G G...5' |
Примечание. ^ - место рестрикции.
II. Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот.
Молекулярная гибридизация - м олекулярно-биологическая техника, основанная на способности одноцепочечной молекулы изучаемой ДНК/РНК специфически соединяться с комплементарными одноцепочечными зондами (молекулами-свидетелями) с образованием гибридных дуплексов, которые флюоресцируют или меняют цвет реакционной смеси.
Методы молекулярной гибридизации позволяют в ыявлять степень сходства двух молекул ДНК, что используется для эволюционного анализа, для идентификации и типирования микроорганизмов, а также для изучения экспрессии генов.
Варианты проведения молекулярной гибридизации.
1. В растворе.
2. В тканевых срезах (in situ). Тканевые срезы депарафинируют, демаскируют нуклеиновые кислоты в них и наносят гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. Проводят денатурацию ДНК, гибридизацию, отмывку несвязавшихся зондов, после чего осуществляют детекцию гибридизировавшихся зондов по флюоресценции.
3. На микрочипах (эррей гибридизация) – наиболее совершенный метод. Позволяет наносить и фиксировать до нескольких сотен тысяч ДНК-зондов на поверхность стеклянного чипа, что дает возможность изучать одновременно все гены, присутствующие в ДНК микроорганизма.
4. На мембранах. Изучаемую ДНК фиксируют на мембранах и к ней добавляют гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. В случае комплементарности зонд связывается с ДНК, после отмывки несвязавшихся зондов регистрируют флюоресценцию.
Этапы реакции гибридизации на мембранах:
А. Выделение ДНК. Методы аналогичны методам выделения ДНК для проведения ПЦР.
Б. Получение мелких фрагментов изучаемой ДНК(не более 5000 – 10000 п. о.). Для этого проводят либо рестрикцию (нарезку рестриктазами) крупной молекулы ДНК, либо ПЦР с образованием небольших ампликонов, либо обработку ультразвуком.
В. Нанесение ДНК на мембрану и фиксация ДНК на мембране:
– дот-блоты или слот-блоты.Перед нанесением ДНК денатурируют – превращают в одноцепочечные молекулы. Затем небольшие фрагменты изучаемой ДНК наносят на мембрану в виде точек (дот-блоты), либо полосок (слот-блоты).
– саузерн-блоты.Небольшие фрагменты изучаемой ДНК предварительно разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле. ДНК переносят из геля на поверхность мембран.
Перенесенную на мембрану ДНК фиксируют при 800С или УФ светом.
Г. Гибридизацияпроводится в несколько этапов:
– обработка предгибридизационным буфером мембраны с ДНК, что увеличивает связывающую способность мембраны;
– приготовление гибридизационного раствора, содержащего буфер и меченый зонд;
– программирование гибридизационной камеры и проведение гибридизации при 650С.
Д. Анализ результатов. Если зонд комплементарен одноцепочечному участку ДНК изучаемого микроорганизма, происходит связывание зонда и исследуемой ДНК. Некомплементарные несвязавшиеся зонды удаляют промыванием. В месте связывания зонда выявляют флюоресценцию или изменение цвета (рис. 30).
Рис. 30. Схема реакции молекулярной гибридизации для обнаружения в образцах ДНК возбудителя специфическим меченным зондом