Недостатки молекулярно-генетических методов.

1. Отсутствие международных протоколов по молекулярно-генетической диагностике различных нозологических форм заболеваний.

2. Необходимость разработки новых подходов к клинической интерпретации получаемых результатов. В этиологической диагностике заболеваний в настоящее время по-прежнему существуют «золотые стандарты», в основу которых положены культуральный или микроскопический методы исследования. Для постановки этиологического диагноза необходимы положительные результаты культурального и микроскопического методов, результаты молекулярно-генетических методов в настоящее время оцениваются как ориентировочные.

Следует помнить, что выявление в клинических образцах ДНК сапрофитных и условно-патогенных микроорганизмов может не означать наличия патологического процесса и поэтому не может быть автоматически интерпретировано как диагноз, особенно на фоне благополучной клинической картины у пациента.

По этой же причине следует с осторожностью использовать молекулярно-генетические методы для анализа образцов с полимикробным сообществом (испражнения, материал из верхних дыхательных путей, материал из гениталий).

3. Высокая стоимость оборудования. Для проведения молекулярно-генетических исследований необходимо комплексное оснащение лаборатории, включающее термоциклер, устройство для ДНК-электрофореза, трансиллюминатор, шейкеры, центрифуги, холодильники, дозаторы, секвенатор, гибридизационную камеру и другое оборудование.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ БАКТЕРИЙ

1. Белки фимбрий, адгезины, компоненты секреторной системы изучают следующим образом:

– клетки дезинтегрируют ультразвуком;

– белки осаждают;

– проводят диализ для освобождения от балласта;

– выделяют очищенный белок при помощи жидкостной хроматографии;

– проводят электрофорез в полиакриламидном геле;

– идентифицируют белок с использованием биомаркеров (меченых поликлональных антител);

– изучают белок: определяют молекулярную массу методом масс-спектрометрии, 3D-структуру методом рентгеноструктурной кристаллографии.

2. Фимбрии выявляют с помощью:

– негативного контрастирования с последующей электронной микроскопией (рис. 41);

– изучения адгезии к поверхности культур клеток Hep2 и др.;

– постановки маннозозависимой реакции гемагглютинации с эритроцитами разных видов животных: при добавлении эритроцитов к суспензии бактерий в присутствии 1% раствора D-маннозы происходит склеивание эритроцитов с образованием «зонтика».

3. Гены, кодирующие бактериальные гликаны (пептидогликан, капсульные полисахариды, липополисахариды, системы гликозилирования белков), определяют с помощью сравнительного компьютерного анализа секвенированного генома микроорганизма и геномов хорошо изученных микроорганизмов. Функции генов подтверждают клонированием этих генов в E. coli или нокаутируют эти гены с использованием сайт-специфического мутагенеза.

4. Поверхностные структуры клеточной стенки изучают с помощью сканирующей атомно-силовой микроскопии высокого разрешения (рис. 42).