Методы генетики соматических клеток

С помощью этих методов изучают наследственность и изменчивость соматических клеток, что в значительной мере компенсирует невозможность применения к человеку метода гибридологического анализа.

Методы генетики соматических клеток, основанные на размножении этих клеток в искусственных условиях, позволяют не только анализировать генетические процессы в отдельных клетках организма, но благодаря полноценности наследственного материала, заключенного в них, использовать их для изучения генетических закономерностей целостного организма.

В связи с разработкой в 60-х гг. XX в. методов генетики соматических клеток человек оказался включенным в группу объектов экспериментальной генетики. Благодаря быстрому размножению на питательных средах соматические клетки могут быть получены в количествах, необходимых для анализа. Они успешно клонируются, давая генетически идентичное потомство. Разные клетки могут, сливаясь, образовывать гибридные клоны. Они легко подвергаются селекции на специальных питательных средах и долго сохраняются при глубоком замораживании. Все это позволяет использовать культуры соматических клеток, полученные из материала биопсий (периферическая кровь, кожа, опухолевая ткань, ткань эмбрионов, клетки из околоплодной жидкости), для генетических исследований человека, в которых используют следующие приемы: 1) простое культивирование, 2) клонирование, 3) селекцию, 4) гибридизацию.

Культивирование позволяет получить достаточное количество клеточного материала для цитогенетических, биохимических, иммунологических и других исследований.

Планирование— получение потомков одной клетки; дает возможность проводить в генетически идентичных клетках биохимический анализ наследственно обусловленных процессов.

Селекция соматических клеток с помощью искусственных сред используется для отбора мутантных клеток с определенными свойствами и других клеток с интересующими исследователя характеристиками.

Гибридизация соматических клеток основана на слиянии совместно культивируемых клеток разных типов, образующих гибридные клетки со свойствами обоих родительских видов. Для гибридизации могут использоваться клетки от разных людей, а также от человека и других животных (мыши, крысы, морской свинки, обезьяны, джунгарского хомячка, курицы).

Гибридные клетки, содержащие два полных генома, при делении обычно «теряют» хромосомы предпочтительно одного из видов. Например, в гибридных клетках «человек — мышь» постепенно утрачиваются все хромосомы человека, а в клетках «человек — крыса» — все, кроме одной, хромосомы крысы, с сохранением всех хромосом человека. Таким образом можно получать клетки с желаемым набором хромосом, что дает возможность изучать сцепление генов и их локализацию в определенных хромосомах.

Постепенная потеря хромосом человека из гибридных клеток параллельно с изучением ферментов дает возможность судить о локализации гена, контролирующего синтез данного фермента, в определенной хромосоме.

Благодаря методам генетики соматических клеток можно изучать механизмы первичного действия и взаимодействия генов, регуляцию генной активности. Они позволяют судить о генетической гетерогенности наследственных болезней, изучать их патогенез на биохимическом и клеточном уровнях. Развитие этих методов определило возможность точной диагностики наследственных болезней в пренатальном периоде.

Рестрикционный анализ — метод анализа ДНК с использованием рестрикционных эндонуклеаз.

Полимера́ зная цепна́ я реа́ кция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

Электрофорез ДНК — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине) и форме (в случае, если ДНК образует вторичные структуры, например шпильки). Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее.

К образцам обычно добавляют низкомолекулярный краситель (например, динитрофенол), чтобы визуализировать ход электрофореза в процессе. Краситель также необходим для того, чтобы определить, когда стоит остановить процесс.

Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Чаще всего используются буферы, содержащие ЭДТА, трис и борную кислоту TAE и TBE. Буфер необходим для повышения ионной силы раствора, в котором будет происходить разделение молекул ДНК под действием приложенного электрического поля.

После разделения (иногда краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах.

Определение размеров производят путем сравнения коммерчески доступных фрагментов ДНК (DNA ladder, «линейка»), содержащий линейные фрагменты ДНК известной длины.

Для электрофоретического анализа ДНК обычно используют агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случае секвенирования) гели.

Разработка метода обратной транскрипции ДНК на молекулах мРНК определенных белков с последующим размножением этих ДНК привела к появлению ДНК-зондов для различных мутаций нуклеотидных последовательностей человека. Использование таких ДНК-зондов для гибридизации с ДНК клеток пациента дает возможность выявлять у него соответствующие изменения в наследственном материале, т.е. диагностировать определенные виды генных мутаций (генодиагностика).

Важными достижениями молекулярной генетики последних десятилетий явились работы по секвенированию — определению нуклеотидной последовательности ДНК.

Это стало возможным благодаря открытию в 60-х гг. XX в. ферментов — рестриктаз, выделенных из бактериальных клеток, которые разрезают молекулу ДНК на фрагменты в строго определенных местах. В естественных условиях рестрикгазы защищают клетку от проникновения в ее генетический аппарат и размножения в нем чужеродной ДНК. Применение этих ферментов в эксперименте дает возможность получать короткие фрагменты ДНК, в которых относительно легко можно определить последовательность нуклеотидов.

В настоящее время полностью установлена последовательность нуклеотидов многих генов человеческого генома, в том числе генов α - и (β -глобиновых цепей гемоглобина, некоторых полипептидных гормонов (инсулина, гормона роста, хорионического соматотропина, пролактина). Интенсивно изучаются нуклеотидные последовательности генов актинов, тубулинов, интерферонов. Этими исследованиями выявлена высокая степень генетического полиморфизма у человека, который часто не проявляется фенотипически.

Методы молекулярной генетики и генной инженерии позволяют не только диагностировать целый ряд генных мутаций и устанавливать нуклеотидную последовательность отдельных генов человека, но и размножать (клонировать) их и получать в большом количестве белки — продукты соответствующих генов.

Клонирование отдельных фрагментов ДНК осуществляется путем включения их в бактериальные плазмиды, которые, автономно размножаясь в клетке, обеспечивают получение в большом количестве копий соответствующих фрагментов ДНК человека. Последующая экспрессия рекомбинантных ДНК в бактериях позволяет получить белковый продукт соответствующего клонированного человеческого гена.

Таким образом, с помощью методов генной инженерии стало возможно получать на основе человеческих генов некоторые первичные генные продукты (инсулин). Это определяет перспективы терапии наследственных болезней, обусловленных связанным с генными мутациями дефицитом нормальных продуктов генов.

Дальнейшее совершенствование методов молекулярной генетики обеспечит возможность полного определения нуклеотидных последовательностей не только структурных, но и регуляторных локусов генома человека, а разработка методов включения в человеческий геном нормальных нуклеотидных последовательностей в перспективе может стать основой генотерапии.