Кафедра клинической лабораторной диагностики

Современные новые методы диагностики инфекционных болезней. Метод геноиндикации.

Учебно-методическое пособие для студентов

Автор: доцент кафедры, Ильинская Т.Н.

Гомель, 2004 год

Введение.

Хотя классические методы, такие как бактериологический, бактериоскопический и биохимический и обладают сравнительно высокой чувствительностью и специфичностью, однако по многим причинам они не могут использоваться для рутинного скринингового обследования пациентов. Внедрённые недавно методы, основанные на амплификации ДНК, такие как ПЦР, лигазная цепная реакция и транскрипционная амплификация обеспечивают не только быстрое получение результатов, но обладают также большей чувствительностью в сравнении с традиционными методами идентификации.

Цель: Получение знаний и практических навыков по новым методам диагностики инфекционных заболеваний – методам генной индикации.

Задачи:

· Знать особенности преаналитического этапа метода ДНК-гибридизации.

· Знать метод гибридизации ДНК и РНК: схема постановки, реагенты, условия и учёт результатов.

· Знать метод полимеразной цепной реакции: схема постановки, реагенты, условия и учёт результатов. Возможные ошибки.

· Иметь навыки в постановке диагностических реакций.

· Уметь оценить полученные результаты и выдать заключение по проведенному исследованию.

Практические навыки:

· Сбор и доставка патологического материала.

· Особенности обработки материала для проведения ДНК-гибридизации.

· Особенности обработки материала для проведения ПЦР

· Ознакомление с оборудованием изспользуемым для проведения ДНК-гибридизации.

· Ознакомление с оборудованием изспользуемым для проведения ПЦР.

Основные учебные вопросы:

1. Метод гибридизации ДНК и РНК в диагностике бактериальных и вирусных инфекций.

2. Полимеразная цепная реакция в диагностике бактериальных и вирусных инфекций. Ограничения метода.

3. Индикация некультивируемых форм бактерий.

4. Перспективы развития метода геноиндикации.

5. Использование для лечения и профилактики инфекционных заболеваний методов генной инженерии. Перспективы.

6. Методы изучения генетики микроорганизмов. Методы обнаружения плазмид.

Основная литература:

1. А.Н. Маянский Микробиология для врачей (очерки патогенетической микробиологии). Нижний Новгород: Изд-во НГМА, 1999.

2. Медицинская микробиология. Часть первая./ Под. ред. А.М. Королюка и В.Б. Сбойчакова. –СПб., 1999. – 272с.

3. Медицинская микробиология./ Под. ред. В.И. Покровского. –М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999.

4. Конспект лекций.

Дополнительная литература:

1.: Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для мед. вузов./ Под ред. А.И. Коротяева, С.А. Бабичева –СПб.: СпецЛит, 2000.

Вспомогательные материалы по теме.

ГЕНОИНДИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Обнаружение и идентификация возбудителей инфекционных заболеваний представляет собой одну из важнейших задач микробиологии. Решение этой задачи обеспечивается богатым арсеналом методических приемов, начиная от классических методик микробиологического тестирования и заканчивая иммунохимическими и молекулярно-биологическими методами. В каждом случае характер и сложность диагностических приемов зависят от биологии искомых возбудителей инфекции, которые претерпевают адаптивные изменения под воздействием экологических факторов, антибактериальной терапии и т.д.

Поэтому в последние годы все чаще и чаще традиционные, а порой и недавно наиболее перспективные методы диагностики оказываются недостаточными или принципиально неприменимыми. В связи с этим в настоящее время при проведении диагностических исследований стремятся к выявлению в исследуемых образцах специфических фрагментов нуклеиновых кислот патогенов.

Одним из наиболее часто применяющихся с этой целью методов является гибридизация специфических последовательностей нуклеиновых кислот (зондов) с фрагментами генома искомых патогенов, с помощью которой проводят обнаружение в исследуемых образцах, идентификацию возбудителей до вида, рода или семейства, дифференцируют патогенные и непатогенные штаммы одного вида (токсигенные и нетоксигенные Escherichia coli. Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica и т.д.). Зонды представляют собой меченные радиоактивными (³²Р, ³⁵S, ¹²⁵J) или хромогенными (фотобиотин, аминолинк) метками одноцепочные участки нуклеиновых кислот (в большинстве случаев ДНК) длиной, как правило, 32-37 нуклеотидов, которые связываются с комплементарными последовательностями в процессе реассоциации ДНК. Эти последовательности, в зависимости от типа используемых гибридизационных проб, могут быть обнаружены в геноме штаммов одного или близко родственных видов либо в гомологичных генах изолятов различных видов (например, гены, кодирующие синтез термолабильных энтеротоксинов E.coli и V.cholerae, R-плазмиды Serratia и Klebsiella spp.).

Искомые последовательности доступны обнаружению, даже если они составляют 0.001% генома возбудителя. При этом не требуется обязательного изолирования чистой культуры патогенов, и процесс идентификации в различных клинических биосубстратах занимает от 6 до 48 ч. Чувствительность метода составляет от 2х10³ до 1х10⁶ КОЕ/мл, специфичность гибридизации очень высока (0, 5-0, 8% ложноположительных результатов).

Вместе с тем достаточно сложная техника проведения экспериментов по гибридизации с использованием радиоактивно меченых проб препятствует широкому внедрению метода в диагностические лаборатории. Поэтому в последнее время широкое применение получила полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на многократном копировании выбранной нуклеотидной последовательности генома с помощью ДНК-полимеразы, синтезирующей взаимно комплементарные цепи ДНК, начиная с двух олигонуклеотидных праймеров (затравок), комплементарных противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих последовательность-мишень и ориентированных 3, 5-концами навстречу друг другу. При синтезе ДНК праймеры физически встраиваются во вновь образуемые молекулы ДНК, и каждая из таких цепей, синтезированных с помощью одного из праймеров, может служить матрицей для синтеза комплементарной нити с помощью другого праймера. Для этого лишь надо денатурировать образовавшиеся на первой стадии реакции двухцепочечные молекулы ДНК, дать возможность праймерам комплементарно присоединиться к ДНК и осуществить элонгацию. Эти три стадии составляют цикл ПЦР и приводят к удвоению количества ДНК в образце.

Любая из вновь синтезированных цепей ДНК служит матрицей для синтеза новых молекул ДНК, поэтому они будут соответствовать по длине и последовательности участку ДНК, выбранному для амплификации. Эти молекулы образуются уже после второго цикла ПЦР, а в последующих циклах будет происходить экспоненциальный рост числа именно таких, ограниченных с двух концов праймерами, молекул ДНК. Их количество определяется формулой (2ⁿ-2n)х, где n - число циклов ПЦР, 2n - количество ПЦР-продуктов неопределенной длины, синтезируемых постоянно, но " разбавляемых" в ходе реакции, x - первоначальное количество копий матрицы в образце.

Следовательно, теоретически за 20 циклов ПЦР можно амплифицировать 2²⁰ (около 10⁶) копий заданного участка ДНК, что позволяет теоретически обнаруживать единственную молекулу искомой ДНК в образце. Для получения удовлетворительных результатов исследования, как правило, достаточно провести 27-30 циклов ПЦР в связи с тем, что к этому моменту накопление ДНК-продукта из экспоненциального становится линейным из-за истощения пула нуклеотидов, праймеров, инактивации полимеразы, конкуренции со стороны неспецифических продуктов амплификации и от прочих причин. Выявление амплифицируемых фрагментов осуществляют, как правило, путем их разделения методом гель-электрофореза и визуализации в УФ свете после окрашивания этидием бромида или посредством ДНК-ДНК-гибридизации с внутренним олигонуклеотидом (зондом).

Из схемы реакции становится понятным, что метод обладает широкими возможностями для обнаружения возбудителей инфекционных заболеваний различной этиологии. Относительная простота постановки, быстрота, высокая чувствительность и специфичность придают полимеразной цепной реакции значительные преимущества при лабораторной диагностике вирусных инфекций, а также при выявлении микроорганизмов, культивирование которых слишком длительно и трудоемко, а различные варианты иммунохимической диагностики (серологическое тестирование, иммуноферментньй анализ, метод флюоресцирующих антител не вполне надежны. Этим методом удается обнаруживать около 100 м.к./мл в пробе с применением для визуализации результатов электрофореза в агарозном геле или 1-25 клеток при использовании с этой целью дот-гибридизации. Незаменима ПЦР при обнаружении вирулентных штаммов бактерий, достигаемом путем амплификации (фрагментов генов, кодирующих различные факторы вирулентности (tox - ген Corynebacterium diphtheriae. inv - ген Y.enterocolitica). Для исследования с использованием ПЦР при выявлении патогенных микроорганизмов доступны не только свежевзятые образцы (биоптаты и т.д.), но и замороженные, фиксированные этанолом или формалином пробы.

Полимеразная цепная реакция - единственный на настоящее время методический подход, способный доказать присутствие в образце обладающих патогенным потенциалом некультивируемых форм микроорганизмов с последующей их идентификацией путем амплификации, к примеру, генов 16SрРНК, их секвенирования и последующего сравнения полученных результатов с нуклеотидными последовательностями аналогичных генов известных микроорганизмов. Таким образом были идентифицированы возбудители бациллярного ангиоматоза Rochalimaea henselae, болезни Виппла - актиномицет Tropherima whippelii. В настоящее время с использованием ПЦР ведется поиск предполагаемых ранее инфекционных агентов - возбудителей саркоидоза, заболевания Крона, малакоплакии, хронического возвратного остеомиелита.