Выявление конъюгативных R-плазмид

Испытуемые бактерии: клинические штаммы антибиотикорезистентных шигелл Зонне. Реципиент: штамм E. coli W 1655 Tra^- Lac⁺ Nl^r сохранивший видовую чувствительность к антибиотикам и имеющий нетрансмиссивную хромосомную устойчивость к налидиксовой кислоте. Питательная среда для определения детерминант приобретенной антибиотикоустойчивости: среда Эндо, содержащая раздельно антибиотики - тетрациклин (64 ЕД/мл), левомицетин (64 мкг/мл), стрептомицин (128 ЕД/мл), канамицин (128 ЕД/мл), ампициллин (256 ЕД/мл). Селективная среда для выделения антибиотикоустойчивых рекомбинантов - указанная среда с антибиотиками, содержащая дополнительно к каждому антибиотику налидиксовую кислоту (64 мкг/мл).

Для выявления детерминант антибиотикоустойчивости засевают петлей суточные бульонные культуры щигелл Зонне на секторы сред Эндо с различными антибиотиками и без антибиотиков (контроль).

На каждую чашку делают посев 4-12 штаммов путем нанесения одной петли культуры радиальным штрихом. С целью изучения трансмиссивности детерминант антибиотикоустойчивости путем конъюгации вносят по 0, 5 мл тех же культур Зонне (доноры) в пробирки с 4 мл бульона Хоттингера и добавляют в каждую пробирку по 0, 5 мл суточной бульонной культуры эшерихий (реципиента), т.е. для каждого штамма шигелл используют одну пробирку. Посевы инкубируют при 37°С.

Через 24 ч учитывают антибиотикорезистограммы. Шигеллы Зонне имеют детерминанты приобретенной антибиотикоустойчивости к тем антибиотикам, на средах с которыми выросли сплошным газоном или отдельными колониями по ходу посева, и чувствительны к тем антибиотикам, на средах с которыми роста нет. В это же время делают высев из пробирок с конъюгационной смесью бактерий на секторы селективных сред для выделения антибиотикоустойчивых рекомбинантов. Высев из смеси делают конкретно для каждого штамма шигелл только на селективные среды с теми антибиотиками, устойчивость к которым обнаружена при определении детерминант антибиотикорезистентности. Методика посева на секторы сред идентична уже описанной. Чашки с посевами инкубируют при 37°С 24 ч, после чего учитывают результаты. Шигеллы Зонне имеют трансмиссивные детерминанты устойчивости к тем антибиотикам, на селективных средах с которыми вырастают газонами или отдельными колониями темно-красного цвета рекомбинанты кишечной палочки. Отсутствие роста рекомбинантов на селективных средах с антибиотиками свидетельствует о нетрансмиссивности детерминант устойчивости к этим антибиотикам. Конъюгативная трансмиссивность комплекса детерминант антибиотикоустойчивости с большой вероятностью указывает на их принадлежность к конъюгативной R-плазмиде.