Искусственная активация экспрессии генов

Изменение экспрессии генов, кодирующих ферменты целевого пути, один из основных способов управления потоками метаболитов в клетке. Наиболее энергетически выгодно осуществлять регуляцию такого рода на самом низшем, транскрипционном уровне экспрессии. Чаще всего под изменением регуляции понимают замену промоторных участков генов. Так как метаболическая инженерия, прикладная область молекулярной биологии, применяемая в ней искусственная регуляция должна удовлетворять специфике биотехнологического производства.

Идеальный с точки зрения промышленного производства регулируемый промотор должен сильно репрессироваться, в условиях дерепрессии обеспечивать высокий уровень транскрипции, а переход между состояниями репрессии и дерепрессии должен осуществляться простым и дешевым способом [ Goldstein и Doi, 1995; Makrides, 1996 ]. В зависимости от цели регуляции гена, перечисленные свойства промотора могут быть более или менее критичными [ Sawers и Jarsch, 1996 ]. Так для целей синтеза гетерологичного белка, в случае его токсичности сильный уровень репрессии является наиболее важным параметром [ Wü lfing и Plü ckthun, 1993 ]. В то же время при синтезе нетоксичных продуктов важнее параметр «сила промотора» нежели эффективность его репрессии. Однако, например, в метаболической инженерии для случая обеспечения синтеза ферментов целевого пути метаболизма важно ни сколько абсолютное количество каждого фермента, сколько их оптимальное относительное друг к другу количество [ Jensen и Hammer, 1998 ]. Поэтому даже максимализация силы промотора не является критически важным условием обеспечения эффективного биотсинтеза. Универсальным для большинства практических приложений остается требование простого и дешевого способа индукции/дерепрессии применяемого промотора. Примеры использования различных систем регуляции представлены в Таблице 1.1 (из Makrides, 1996).

Таблица 1.1

Обращает на себя внимание широкое применение регуляции на основе изопропил-β -D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ). К недостаткам индукции посредством ИПТГ можно отнести его высокую стоимость и токсичность [ Figge и др., 1988 ]. Поэтому применение подобных систем регуляции требует последующей процедуры очистки и выгодно лишь в условиях синтеза в небольших масштабах дорогостоящих продуктов, таких как современные лекарственные и антибиотические вещества. Существенное же преимущество использования данной регуляций состоит в хорошей изученности молекулярных механизмов ее осуществления и большого числа сильных, регулируемых промоторов: lac, tac, trc, промотора гена 1 фага T7 [ Studier и др., 1990 ], позволяющих быстро синтезировать в значительных количествах целевой продукт. До сих пор систему LacI-зависимой регуляции используют для создания новых, регуляторных промоторов [ Zhao и др., 2010 ]. Однако, например для сильных систем экспрессии на основе промотора фага T7, в последнее время усилилась тенденция ухода от ИПТГ-зависимой индукции в сторону термоиндукции [ Wang и др., 2004 ], арабинозной индукции [ Xu и др., 2006 ] или авто-индукции лактозой [ Studier, 2005 ].

Подавляющее большинство других систем регуляции отличается от ИПТГ-зависимых лишь химической природой индуцирующего агента: 3-индол акриловая кислота [ Masuda и др., 1996 ], L-арабиноза [ Taylor и др., 1992 ], налидиксовая кислота [ Shirakawa и др., 1984 ], ангидротетрацеклин [ Ehrt и др., 2005 ], пропионат натрия [ Lee и Keasling, 2005 ] или хлорида натрия [ Herbst и др., 1994 ]. Каждая из систем обладает некоторым достоинством относительно другой, но роднит их всех необходимость физического добавления индуктора в процессе культивирования клеток. Данное обстоятельство не мешает использовать вышеупомянутые системы при мелкомасштабном производстве, однако в условиях крупномасштабного производства оно является недостатком. В этом отношении система индукции посредством температуры выглядит более перспективно, однако ее применение осложнено невозможностью быстрого изменения температуры в больших культуральных объемах, повышением вероятности образования телец включения [ Bhandari и Gowrishankar, 1997 ] и протеаз термального шока [ Hasan и Shimizu, 2008 ].

Интересной альтернативой перечисленным системам регуляции являются системы, индуцирующие подконтрольную транскрипцию в ответ на внутриклеточные метаболические изменения в процессе культивирования. Преимущество использования данных систем в том, что регуляция не требует активного вмешательства извне на этапе запущенной ферментации. К системам метаболической регуляции можно отнести системы чувствующие изменение количества источников неорганического азота фосфора (P_i) [ Oka и др., 1985; Su и др., 1990 ], (N_i) [ Schroeckh и др., 1999 ], растворенного кислорода (O₂) [ Khosla и др., 1990; Sawers и Bö ck, 1989; Oxer и др., 1991 ]. Так, создавая искусственную регуляцию, чувствительную к внеклеточной концентрации P_i, используют промоторы P _phoA и P _ugp генов Pho регулона. Известно, что при падении внеклеточной концентрации источников неорганического фосфата P_i ниже 1mM транскрипция с промоторов Pho регулона активируется [ Wanner, 1993; Hsieh и Wanner, 2010 ]. Схожий принцип регуляции транскрипции с промотора системы утилизации азота P2 _glnA лежит в основе индукции за счет падения концентрации источников внеклеточного N_i. Активация транскрипции начинается при падении концентрации аммония ниже 1mM. При регуляции через падение концентрации O₂ все предложенные системы (на основе промоторов: P _vhb, P _pfl и P _nirB), по-видимому, являются зависимыми от фактора FNR [ Salmon и др., 2003 ]. Существенным преимуществом использования подобных систем регуляции является, как уже отмечалось, минимальное физическое вмешательство в процесс культивирования. Интересно, что схему активации транскрипции описанных выше систем предложено сегодня в некоторых случиях копировать для исходно ИПТГ-зависимой T7 экспрессионной системы [ Studier, 2005 ].

Заметим, что для азотной регуляции одним из ключевых факторов является связывание промотора со специальной субъединицей РНК полимеразы, σ ⁵⁴, активирующей гены в условиях голодания по азоту [ Hirschman и др., 1985 ]. Принцип регуляции на основе сигма факторов интересная альтернатива описанным ранее системам. Так как в процессе промышленного культивирования клетки любого штамма-продуцента проходят стадию экспоненциального роста и переходят в стационарную фазу роста, потенциально перспективным является использование природных промоторов активирующихся в стационарной фазе роста. Используя современные методы анализа, на данный момент уже найдены некоторое количество таких промоторов [ Shimada и др., 2004 ]. Зачастую это промоторы, узнающиеся субъединицой РНК полимеразы стационарной фазы, σ ^S [ Lacour и Landini, 2004 ]. Более того, для возможности тонкой настройки уровня желаемой экспрессии была создана библиотека искусственных σ ^S-зависимых промоторов [ Miksch и др., 2005 ].

Интересный подход, ознаменовавший появление принципиально новых возможностей обеспечения регуляции транскрипции целевого гена, был предложен исследователями Farmer и Liao [ Farmer и Liao, 2000 ]. Они обратили внимание, что истощение источников N_i в качестве фактора актвации различных биосинтетических процессов не всегда удобно использовать в практических целях. Поэтому было предложено изменить регуляцию промотора P2 _glnA таким образом, чтобы транскрипция с него была чувствительна не к истощению источников N_i, а к появлению внутриклеточных излишков источников углерода, что обычно проявляется в E. coli через активацию синтеза ацетилфосфата и затем ацетата. В итоге, была создана искусственная регуляторная цепь, обеспечивающая синтез целевого продукта в ответ на появление ацетилфосфата.

Все больший прогресс в понимании глубоких основ регуляции промоторов белковыми факторами [ Cox и др., 2007 ] позволяет предположить, что будущее искусственной транскрипционной регуляции, видимо, за использованием полностью синтетических промоторов, обеспечивающими необходимый уровень транскрипции в ответ на оптимальный для биотехнологического процесса сигнал.