Получение генетической конструкции содержаще хитинсвязывающий домен (pET CBD).

Результаты и обсуждение

В ходе выполнения курсовой работы на тему «Получение рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста» нами был осуществлён синтез гена VEGF 165 человеческого и его клонирование в экспрессионный вектор pET-23d(+). Получена плазмида pER VEGF₁₆₅. Экспрессия белка была незначительной. Поэтому в настоящей работе уделялось большое внимание повышению уровня экспрессии и разработке методов выделения и очистки полученного рекомбинантного белка.

Важным критерием получения биологически активной формы рекомбинантного VEGF 165 является образование внутримолекулярного цистиинового узла и димеризация. Поэтому в качестве продуцента были выбраны специальный штамм E. coli C3030 содержащий встроенную в геном дисульфидизомеразу.

Получение генетической конструкции содержаще хитинсвязывающий домен (pET CBD).

С целью повышения экспрессии целевого белка, а также разработка более эффективной методики очистки было решено получить гибридный белок содержащий хитин связывающий домен (CBD) сайт TEV протеазы (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly) -VEGF165. Получение генетической конструкции осуществлялось в несколько этапов.

Амплификацию олигонуклеотида кодирующего хитинсвязывающий домен проводил при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами Т7-prim и CBD2, содержащими сайты рестриктаз XbaI и BglII соответственно в качестве исходной матрицы использовали pTWIN1 содержащий последовательность кодирующую хититн связывающий домен. Очистка ПЦР-продукта осуществлялась с помощью набора MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN, #27106).

Рис. 1. Рестрикционная карта вектора pTWIN1.

В качестве экспрессионного вектора был выбран плазмидный вектор pET-32b(+). Данный вектор содержит в полилинкерной последовательности сайты рестрикции XbaI и BglII, по которым и была произведена вставка амплифицированного фрагмента с учетом корректной рамки считывания.

Рис. 2 Полилинкерная последовательность вектора pET-32b(+).

В результате чего была получена рекомбинантная плазмида pET CBD.

Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е.coli ER2566. Суспензию трансформированных клеток рассевали на чашки с селективной средой. Клоны, полученные при высевании трансформированных клеток на агаризованную среду с добавлением ампициллина, пересевали в жидкую среду с добавлением ампициллина для выращивания и отбора рекомбинантов.

Отбор рекомбинантов осуществляли по результатам электрофореза клеточных лизатов клонов в ПААГ представленного на рис.

Рис. 3. Электрофореграмма рекомбинантов.

Для последующей работы были отобраны клоны. Выделение плазмиды для последующей трансформации компетентных клеток E.сoli ER2566 осуществлялось из отобранных клонов с помощью набора Promega (по протоколу производителя). Для подтверждения строения вставки гена рекомбинантного белка, полученные плазмиды были просеквенированы по методу Сенгера (в компании Евроген). Анализ нуклеотидной последовательности плазмиды pET CBD подтвердил правильность вставки CBD фрагмента.