![]() Главная страница Случайная страница КАТЕГОРИИ: АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника |
Выделение и очистка сосудисто-эндотелиального фактора роста. ⇐ ПредыдущаяСтр 3 из 3
Полученный продуцент E.coli C3030/pCBD-VEGF165 культивировали при 370С до оптической плотности 0, 6-0, 7, затем индуцировали ИПТГ и выращивали при 300С в течении 16 часов. Биомассу штамма продуцента гибридного белка CBD-VEGF165 подвергли ультразвуковой дезинтеграции в буфере, содержащем 2 М мочевину. Центрифугированием отделили растворимую фракцию, содержащую гибридный белок, от нерастворимого осадка. Использую сродство VEGF165 к гепарину полученный супернатант нанесли на колонку заполненную сорбентом HP Heparin-Sepharose. Элюировали градиентом раствора NaCl от 0%-100%.
Рис. 7. Электрофореграмма SDS-PAGE 15% в невостанавливающих и восстанавливающих условиях фракций после элюции с гепарин сефарозы.
По результатом проведенного электрофореза в невостанавливающих условиях были отобраны фракции для дальнейшей работы. Полученные фракции были объедены и сконцентрированы методом ультрафильтрацией с целью дальнейшего протеолитического расщепления гибридного белка по сайту TEV. Полученный концентрат обработали согласно протоколу раствором TEV протеазы и инкубировали в течении 15 часов. В результате гидролиз составил более 50%.
Далее смесь содержащую продукты ферментативного гидролиза очищали от компонентов содержащих хитин связывающий домен инкубацией с хитиновым сорбентом. В результате были удалены гибридный белок и собственно хитин связывающий домен Рис.9. Рис.9. Электрофореграмма SDS-PAGE 15%
Полученный фильтрат содержащий VEGF165 дочищали от оставшихся примесей методом ВЭЖХ а сорбенте С18. Анализ фракций осуществляли с помощью MALDI-масс-спектрометрии. Найденное значение массы VEGF165 Мэксп = 19 165 Да соответствует расчетной величине Мрасч = 19 165 Да. Фракции содержащие чистый rhVEGF 165 были лиофилизированны. В результате выход целевого белка на конечной стадии составил 2 мг с литра биомассы.
|