ЗАНЯТИЕ № 9

ТЕМА: Спектральные методы исследования макромолекул. Флуоресцентные методы

Цель: Изучить базовые принципы люминесцентного анализа. Изучить возможности метода для исследования свойств биополимеров

В случаях некоторых молекул поглощение фотона сопровождается испусканием света (флуоресценцией) с большей длиной волны. Подобно спектрам поглощения, спектры люминесценции (флуоресценции) сложных молекул размыты и лишены тонких деталей. Информативными оказываются интенсивность, поляризация и длительность свечения.

Вопросы для рассмотрения на занятии:

1. Энергия возбужденного состояния. Пути растраты энергии. Синглетное и триплетное состояние. Интеркомбинационная конверсия.

2. Время жизни возбужденного состояния. Времена жизни синглетных и триплетных состояний.

3. Квантовый выход флуоресценции. Факторы, определяющие интенсивность флуоресценции. Внутреннее и внешнее экранирование.

4. Температурная зависимость квантового выхода флуоресценции. Эффект Шпольского.

5. Спектры возбуждения и испускания флуоресценции. Стоксов сдвиг при флуоресценции и фосфоресценции.

6. Тушение флуоресценции. Уравнение Штерна-Фольмера.

7. Флуоресценция субстратов и коферментов.

8. Собственная флуоресценция аминокислот. Зависимость характеристик спектров испускания от окружения.

9. Собственная флуоресценция белков. Зависимость характеристик флуоресценции от состояния белка.

10. Флуоресцентные зонды и метки. Основные принципы их использования при изучении свойств биомакромолекул.

11. Поляризация флуоресценции. Формула Яблонского-Перрена.

12. Способы регистрации спектров флуоресценции. Функциональная схема спектрофлуориметра.

Самостоятельная работа

1. Для определения доступности триптофановых остатков растворителю можно использовать тушение триптофановой флуоресценции иодид-ионами. Известно, что белок содержит только один триптофан, флуоресценция которого не тушится иодид-ионами. Каковы возможные объяснения отсутствия тушения? Известно, что белок содержит восемь триптофановых остатков и иодид-ионы тушат 25% флуоресценции. Напрашивается предположение, что два триптофановых остатка доступны растворителю. Укажите несколько фактов, которые могли бы сделать это заключение необоснованным.

2. Когда образуются эксимеры, их спектр возбуждения совпадает со спектром мономера, потому что мономер возбуждается до димеризации. Если присутствует много димеров и димер возбуждается, можно ли ожидать, что спектр возбуждения будет соответствовать спектру поглощения мономера? Поясните.

3. Интенсивность флуоресценции понижается вследствие тушения иодид-ионом. Можно ли ожидать также изменения формы спектров возбуждения и испускания?

4. Дайте описание нескольких возможных механизмов возрастания квантового выхода флуоресцентного хромофора при связывании с ним другой молекулы. Почему иногда могут быть сдвиги спектров возбуждения (или испускания) или обоих вместе?. Происходит ли сдвиг в сторону длинных или коротких волн?

5. Всегда ли спектр возбуждения флуоресцирующего хромофора такой же, как спектр поглощения? Поясните.

6. Белок, содержащий десять триптофановых остатков, имеет сильную триптофановую флуоресценцию. Маленькая молекула, способная прочно связываться с белком, фактически не изменяет его флуоресценции, хотя известно, что в участке связывания имеется два триптофановых остатка. Дайте несколько возможных объяснений этому.

7. Флуоресценцирующий хромофор ковалентно присоединен к белку. Измерена поляризация флуоресценции в зависимости от ионной силы буфера, в котором суспендирован белок: найдено, что она заметно уменьшается по мере возрастания ионной силы. Как влияет на белок возрастание ионной силы?

Литература

· Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. – М., 1980, стр. 415-449 (Глава 15)

· Владимиров Ю.А. Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. – М., 1989, стр. 27-69 (Глава 2)

· Рубин А.Б. Современные методы биофизических исследований. Практикум по биофизике. – М., 1988, стр. 98-110

· Губанов Н.И. Медицинская биофизика. – М., 1978, стр. 79-88

· Волькенштеин М.В. Биофизика. – М., 1988, стр. 144-148

· Рощупкин Д.И., Артюхов В.Г. Основы фотобиофизики. – Воронеж, 1997, стр. 19-34 (Глава 2, 3)