Генотипическая идентификация

Впервые ДНК-типирование в судебно-медицинских целях было использовано в 1985 году профессором Лестерского университета Великобритании А. Джефрисом. В начале 90-х годов ХХ столетия для исследования вариабельных фрагментов ДНК впервые была применена полимеразная цепная реакция (ПЦР), разработанная американским ученым К. Мюллисом. Чрезвычайно высокая достоверность и универсальность метода дала импульс к ее широкому применению не только в судебно-медицинских целях, но и в других отраслях медицинской науки.

Структура ДНК каждого отдельно взятого человека в достаточной степени уникальна. Именно это определяет фенотипическое разнообразие человеческих популяций. Каждый человек характеризуется строго индивидуальным, присущим только ему, набором фенотипических признаков. Такой полиморфизм является отображением генетического многообразия наследственной информации.

ДНК содержит 3 класса последовательностей:

1. Сателлитная ДНК.

2. Умеренные повторы.

3. Уникальные участки ДНК.

Сателлитная ДНК, не кодирует информацию о структуре белков, образована многократно повторяющимися (сотни тысяч раз) нуклеотидными последовательностями, которые сгруппированы в однородные фрагменты.

Умеренные повторы ДНК содержат десятки тысяч повторяющихся нуклеотидных последовательностей (тандемных повторов) отличающихся по длине, локализации и последовательности азотистых оснований.

Уникальные участки ДНК представлены неповторяющимися, единичными нуклеотидными последовательностями, на их долю приходится около 70% ДНК генома и она кодирует большую часть синтезируемых в клетке белков. Полиморфизм уникальных участков ДНК определяется строго индивидуальной первичной последовательностью нуклеотидов в геномах сравниваемых индивидов.

Полиморфизм (разнообразие) сателлитной ДНК в геномах различных индивидуумов обусловлен либо неодинаковой длиной тандемных повторов, либо различной их локализацией на протяжении молекулы ДНК.

Метод генотипической идентификации основан на выявлении вариабельных фрагментов ДНК, которые не только индивидуальны, но и повторяются во всех клетках организма каждого отдельно взятого человека. Метод является максимально достоверным, точным и универсальным, так как применим для идентификации самых различных объектов биологического происхождения. При высокоточном техническом исполнении метода возможность получения ошибочного результата менее одного на несколько миллиардов случаев. Учитывая количество людей, населяющих Землю, с математической точки зрения, вполне оправдано допустить, что вероятность ошибки стремится к нулю. Таким образом, используя метод ДНК-анализа, можно выделить одного-единственного индивидуума из всего множества живущих на Земле.

Полное совпадение генотипов может наблюдаться только у однояйцевых близнецов, однако даже в этом случае, вследствие точечных мутаций в период раннего эмбриогенеза, возможны различия в структуре единичных нуклеотидов.

В настоящее время идентификационное исследование ДНК осуществляется через ряд последовательных этапов.

Первоначально производят экстрагирование ДНК, т.е. выделение ее из биологических объектов. В свою очередь этот этап подразделяется на несколько стадий.

1. Размельчение и гомогенизация биологического материала. Первоначально объект подвергается механическому измельчению. В дальнейшем исследуемый материал помещается в экстрагирующий раствор, содержащий детергент, буферные соединения и фермент протеиназу К. Таким образом, одновременно с гомогенизацией осуществляется протеолитическое расщепление биологического материала.

2. Удаление белковых фрагментов. В результате ферментативного распада белка образуется раствор, содержащий смесь пептидов различной длины и ДНК. Затем гомогенизированный материал обрабатывается смесью фенола и хлороформа. Чрезвычайно эффективно использование комплексного реактива Chelex 100, который способен в течении часа выделить необходимое количество ДНК.

3. Осаждение ДНК. С этой целью чаще всего используют 70% этиловый спирт. Нередко, когда количества ДНК в исследуемом биологическом материале недостаточно, ее полного осаждения не происходит. Поэтому, в таких случаях целесообразно внесение в полученный раствор ДНК дрожжевой РНК. При этом создается достаточно высокая общая концентрация нуклеиновых кислот в растворе, что способствует их более эффективному осаждению этиловым спиртом. Дрожжевая РНК является индифферентным веществом по отношению к выделенной ДНК и поэтому не оказывает влияния на процесс ее дальнейшего исследования.

4. Рестрикция полинуклеотидной цепи. После выделения ДНК ее обрабатывают специфическими эндонуклеазами (рестриктазами), которые рестриктируют («нарезают») цепочку ДНК в строго определенных точках в соответствии с химической структурой каждой из рестриктаз. В результате образуется смесь фрагментов ДНК с различной длиной и молекулярной массой.

В дальнейшем анализ полиморфизма ядерной ДНК производят с помощью полимеразной цепной реакции. Основу полимеразной цепной реакции составляет процесс амплификации (умножение, увеличение) определенных локусов, осуществляемый с помощью фермента ДНК-полимеразы, обеспечивающей синтез новой цепочки ДНК, идентичной исследуемой.

Ценность и эффективность этого метода заключается в том, что он позволяет получить неограниченное количество копий интересующего фрагмента исследуемой ДНК при минимальных затратах. Высокая чувствительность ПЦР делает возможным исследование объектов малой величины (единичные волосяные луковицы, отдельные чешуйки перхоти, следовые количества крови, спермы, слюны).

Участок ДНК, подвергаемый амплификации, ограничивают внесением в реакционную смесь пары праймеров – коротких нуклеотидных последовательностей, которые комплементарны к 3'-концам каждой из цепочек копируемого фрагмента ДНК. Праймеры являются своеобразными лимитирующими факторами ДНК-полимеразы на вновь синтезируемой копии ДНК. После фиксации праймер становится 5'-концом вновь синтезируемой копии и от него начинается синтез новой цепочки посредством ДНК-полимеразы в направлении 5' → 3'. В качестве строительного материала для построения новых фрагментов нуклеиновой кислоты используются предварительно внесенные в раствор свободные мононуклеотиды.

Весь цикл полимеразной цепной реакции включает несколько этапов, каждый из которых обусловливается определенным температурным оптимумом.

Изначально, в условиях высокой температуры, происходит денатурация молекулы ДНК, т.е. деспирализация и разделение комплементарных цепей. После снижения температуры реакционной смеси происходит фиксация праймеров к 3'-концам амплифицируемых фрагментов. Этот процесс называется отжигом праймеров.

В последующем идет образование двух новых нуклеотидных цепочек посредством ДНК-полимеразы. Дальнейший отжиг праймеров происходит не только на исследуемых фрагментах ДНК, но и на вновь синтезируемых. Поэтому для синтеза новых нуклеотидных последовательностей используется не только анализируемая ДНК, но и ранее образованные копии. С каждым последующим циклом количество вновь синтезируемых копий начинает преобладать над исходной ДНК, вследствие чего отжиг праймеров осуществляется, главным образом, на дочерних фрагментах ДНК. Для амплификации пригодна даже деградированная ДНК, при условии сохранения в ней фрагмента, включающего участки для присоединения праймеров.

Процессу амплификации может быть подвергнут любой локус ДНК, при условии, что последовательность нуклеотидов в нем известна, а значит существует возможность создания соответствующих праймеров. В настоящее время исследуют локусы генов главного комплекса гистосовместимости (HLA), либо STR-локусы, которые характеризуются малым количеством нуклеотидов в повторе. Необходимо отметить, что исследование по одному локусу в очень редких случаях может быть недостоверным, вследствие возможного совпадения нуклеотидных последовательностей, поэтому, во избежание ошибочных результатов, исследование проводят, как правило, по двум-трем локусам.

Результатом полимеразной цепной реакции является образование множества копий заданного локуса ДНК (см. Приложение). Далее производят анализ либо полиморфизма длины вновь синтезированных фрагментов, либо анализ полиморфизма нуклеотидных последовательностей в них.

Полиморфизм длины рестрикционных участков выявляют с помощью электрофореза в агаровом или полиакриламидном геле (АГ, ПААГ). Распределение амплифицированных копий ДНК в геле зависит от их длины, молекулярной массы, а значит и электрофоретической подвижности. Относительно короткие фрагменты, обладая значительной подвижностью, перемещаются на большее расстояние от места старта. Фрагменты, имеющие достаточно высокую молекулярную массу, отличаются ограниченной подвижностью в электромагнитном поле. Для контрольного сравнения в процессе электрофореза в одну из лунок геля вносят маркеры – фрагменты ДНК с заведомо известной длиной. После обработки геля ядерным красителем, например, бромистым этидием, исследуемые фрагменты визуализируются в УФ-свете в виде параллельно расположенных полосок, отстоящих друг от друга на различном расстоянии. Если человек гомозиготен по исследуемому локусу, то анализируемому фрагменту ДНК будет соответствовать одна полоска, если гетерозиготен – то две. Совокупность полосок, соответствующих исследуемым участкам ДНК, именуется штрих-кодом, который индивидуален у каждого человека и остается неизменным в течение жизни.

Путем сравнения штрих-кодов методом математического анализа устанавливают вероятность происхождения того или иного биологического объекта от конкретного человека, или биологическое родство индивидуумов.

В качестве примера на рисунке 13 приводится схема результатов амплификации ДНК при экспертизе биологического родства.

Рис. 12. Результаты электрофореза амплифицированных фрагментов ДНК в полиакриламидном геле.

Дорожки 1, 5, 6 и 7 отображают результаты копирования заданных фрагментов ДНК, принадлежащих людям, не состоящим в биологическом родстве, т.к. генотип каждого из них содержит аллели, не свойственные генотипам других индивидуумов.

На треках 2 и 3 представлены амплифицированные локусы матери и ребенка соответственно. Дорожка 4 содержит копии фрагментов ДНК предполагаемого отца. В представленном случае генотип ребенка содержит только аллели родительских генотипов, поэтому биологическое отцовство подтверждается. На треках, обозначенных «М», отображены контрольные фрагменты ДНК с заведомо известной молекулярной массой. Это маркеры длины, необходимые для определения молекулярной массы исследуемых фрагментов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Организация и производство медицинских судебных экспертиз в Республике Беларусь // Приложения № 8–25 к приказу Государственной службы медицинских судебных экспертиз от «4» января 2002 г. № 3.

2.Уголовно – Процессуальный Кодекс Республики Беларусь 1999 года.

3. Туманов А.К. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств. – М.: Госюриздат, 1961. – 579 с.

4. Томилин В.В., Барсегянц Л.О., Гладких А.С. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств. – М.: Медицина, 1989. – 304 с.

5. Хохлов В.В., Кузнецов Л.Е. Судебная медицина: Руководство. – Смоленск, 1998. – С.458 – 482.

6. Смольянинов В.М., Татиев К.И., Черваков В.Ф. Судебная медицина: Учеб. для студ. мед. институтов. – 3-е изд., исправ. и доп. – М.: «Медгиз», 1963. – С.424 – 453.

7. ДНК-типирование в судебной медицине: Научное издание / Ю.В. Кухарьков, Г.Ф. Пучков, С.Р. Боровко, Н.А. Миклевич. – Минск: БелАКК, 2003.– 93 с.

8. Громов А.Ю. Об установлении механизма и условий образования следов крови при исследовании вещественных доказательств // Суд. мед. экспертиза. – 1994. – № 2. – С. 40–43.

9. Судебная медицина: Учеб. для мед. вузов / Л.М.Бедрин, И.В.Буромский, М.В.Кисин, А.А.Солохин и др.; Под ред. В.Н.Крюкова. – М.: «Медицина», 1998. – С. 405-427.

ПРИЛОЖЕНИЕ