Мутации генов

Наиболее серьёзные нарушения химии организма связаны с изменением нормальной последовательности азотистых оснований в цепи ДНК. Такие мутации ведут к синтезу неправильных белков и следовательно к расстройству обменных процессов. Каковы же причины такого рода мутаций? Прежде всего, есть определённая, чисто статистическая вероятность включения неправильного азотистого основания при сборке молекулы ДНК или мРНК. Надо сказать, что эта вероятность чрезвычайно мала, не более 10^-7. К тому же существует специальный фермент, часть самой ДНК-полимеразы, своего рода контролёр, вырезающий ошибочно введённые в цепь нуклеотиды и заменяющий их правильными нуклеотидами. Но при огромных масштабах синтеза нуклеиновых кислот, какая-то часть ошибок, даже после репарационной работы такого биокорректора, остаётся неисправленной.

Случайным мутациям может способствовать также таутомерия азотистых оснований, например цитозина (1) и гуанина (3) – компонентов нуклеиновых кислот.

(1) цитозин иминоформа (3) гуанин (4) гидроксиформа

цитозина гуанина

(5) аденин аномальные комплементарные (6) тимин

пары оснований

Хотя эти гетероциклы (1, 3) существуют преимущественно в амино- и оксоформе, для них нельзя пренебрегать и менее устойчивым (одна часть на 10 тысяч) таутомером. Так, 0, 01% цитозина в физиологических условиях (вода, pH 7) находится в иминоформе (2). Примерно такова же и концентрация гидроксиформы (4) в гуанине. Если в момент сборки ДНК даже чрезвычайно малые доли цитозина (1) и гуанина (3) находятся в этих формах (2, 4), теоретически возможно образование неправильных пар азотистых оснований A(5)-C(2) и G(4)-T(6). В них, как и в нормальных парах оснований, имеются хорошие предпосылки для стабилизации водородными связями. Мутациям способствуют некоторые химические вещества. Среди такого рода мутагенов – недостаточно апробированные лекарственные препараты, многочисленные загрязнители окружающей среды, вредные компоненты табачного дыма и недоброкачественной пищи. Например, для придания свежего вида мясным продуктам, в них добавляют незначительные количества солей азотистой кислоты – нитритов. Между тем, в лабораторных опытах азотистая кислота легко превращает аденин (5) в гипоксантин (7), который может связываться в пару уже не с тимином (6), а с цитозином (1):

(5) (7) гипоксангин (7) аномальная (1) цитозин

комплементарная пара

Хорошо известна высокая токсичность таких активных алкилирующих агентов, как йодистый метил, диметилсульфат, азиридин, диазометан. Попадая в организм, они алкилируют связи N-H, O-H, и S-H в аминокислотных остатках полипептидов, белков, ферментов и в нуклеиновых кислотах, приводя к ингибированию их активности. В случае O-алкилирования оснований ДНК (А, рис. 16.4) некоторыми химическими веществами, происходит потеря ими способности сохранять у повреждённой ДНК (Б) нативную структуру, например двойную спираль – за счёт невозможности образования водородных связей.

(6) остаток тимина (3) остаток гуанина О-метилтимин О-метилгуанин

(А) ДНК в норме (Б) ДНК, повреждённая О-алкилированием

1. MeI;

инсертаза

2. H₂O

АП сайт (участок) (9)

(В) ДНК, повреждённая

отщеплением пурина

Рис. 16.4. Схема генетических повреждений ДНК О-алкилированием и отщеплением гуанина при действии алкилирующих мутагенов (АП-сайт – апуриновый участок).

Для борьбы с подобным химическим мутагенезом в клетке имеются белки алкилтрансферазы, которые могут расщепить O-алкильную связь и “залечить” этот вид генетического повреждения. При этом сам белок становится прочно (ковалентно и необратимо) алкилированным, и его, строго говоря, уже нельзя считать ферментом.

При действии алкилирующих мутагенов на ДНК (А) могут образовываться четвертичные соли азотистых оснований, в которых связь между азотом и остатком сахара легко разрывается даже при действии воды. Это приводит к удалению данного основания из цепи ДНК. В повреждённой ДНК (В) в результате отщепления оснований от остатка рибозы возникает апуриновый сайт (АП-сайт) – место, ранее занимаемое пурином (в данном случае гуанином). Этот тип повреждений репарируется ферментами инсертазами, которые способны вставлять (англ. insert) в освободившийся АП-сайт идентичное основание.

Другие ферменты – семейство гликозилаз, - способны сами отщеплять от сахара по гликозидной связи пуриновые и пиримидиновые основания, если они оказались химически (структурно) изменёнными и перестали нормально функционировать. В этом более сложном, чем предшествующий вид, ремонте на молекулярном уровне принимает также участие АП-эндонуклеаза, которая распознаёт возникший АП-сайт и вырезает его (один сахарофосфат). Затем в действие вступают ещё два фермента. Это ДНК-полимераза и полинуклеотидлигаза, которые сшивают два конца разорванной нити ДНК, вставляя между ними новый, нормальный нуклеотид.

Внимание учёных привлекает ещё один класс веществ-мутагенов, называемых интеркаляторами. Молекулы этих соединений имеют плоскую полициклическую структуру, что даёт им возможность проникать в пространство между парами соседних азотистных оснований в цепи ДНК и располагаться там параллельно друг другу. Потенциальными интеркаляторами являются некоторые полиядерные и гетероароматические соединения. При интеркаляции полинуклеотидная цепь, подобно пружине, растягивается, и вблизи места внедрения интеркалятора раскручивается. Сам интеркалятор нередко служит матрицей для встройки лишнего нуклеотида в цепь ДНК при её репликации. Иногда действие интеркалятора может быть весьма специфичным. Например, канцерогенная активность 3, 4-бензпирена (10) вызвана тем, что попадая в организм, он предварительно подвергается ферментативному окислению с образованием эпоксида (11), который затем и интеркалирует в цепь ДНК. Будучи сильным алкилирующим агентом, эпоксид далее ковалентно связывается с амино- и гидроксигруппами компонентов нуклеиновых кислот. Образующаяся при этом химерная ДНК уже не может нормально функционировать.

(10) 3, 4-бензпирен (11) эпоксид бензопирена (Г) химерная ДНК, повреждённая интеркалятором (где D = ДНК).

Как удаление азотистого основания из нормальной цепи ДНК, так и внедрение в её цепь лишних азотистых оснований, представляют собой особенно опасные разновидности мутаций. В результате подобных изменений сдвигается весь генетический год, и образующийся на испорченной матрице белок становится совершенно непригодным для выполнения естественных биологических функций. Тем не менее, при определённых условиях интеркаляторы могут стать базой для создания новых лекарств.

К более мягким последствиям ведут точечные мутации, когда одна пара комплементарных оснований в цепи ДНК заменяется другой. В этом случае в белок включается лишь одна неправильная аминокислота. Если такое включение произошло вдали от активного центра фермента-белка, мутация может оказаться безвредной (молчащая мутация). Если же соответствующая аминокислота играет важную роль в работе белка, мутация ведёт к нарушению его деятельности и к заболеванию. Важнейшими причинами мутаций генного материала являются также и такие внешние воздействия на организм на человека, как различные виды облучения. В результате воздействия УФ-облучения или другой проникающей α - и β -радиации в молекулах ДНК могут возникать повреждения структуры, связанные с тем, что два соседних основания (здесь на схеме цитозин и тимин) в нормальной нити ДНК (А), поглощая квант света, димеризуются с образованием циклобутанового кольца в аномальной ДНК (Д):

(Е) (ж) ДНК-полинуклеот- (А) ДНК в норме фотолиз (Д) ДНК, п повреждённая

(Е, Ж) ДНК, димеризацией

повреждённая соседних

разрывом тяжа оснований

В этом месте теряется целостность генетической информации. Однако возникающая фотомутация может быть исправлена специальным ферментом - фотолиазой, которая сама активируется фотооблучением, и в возбуждённом состоянии распознаёт циклобутановый фрагмент в ДНК и дециклизует его, восстанавливая естественную структуру ДНК (А). Если же под действием ионизирующей радиации в ДНК (А) произошёл разрыв тяжа (сахарофосфатной нити) и образовались два её фрагмента (Е) и (Ж), то в репарации этого генетического повреждения (т.е. в связывании двух фрагментов Е и Ж) участвуют ДНК-полинуклеотидлигазы.

В целом, в случае нарушений деятельности репарирующих ферментов возможно возникновение ряда наследственных заболеваний – высокая чувствительность к химическим мутагенам и солнечному УФ-свету (красная пигментация кожи и др.), неврологические и иммунные расстройства, повышенная ломкость волос, отсталость в физическом, умственном и половом развитии, а также увеличение предрасположенности к раковым заболеваниям кожи и прямой кишки из-за активации онкогенных участков ДНК. Таким образом, накопление мутаций является, возможно, одной из главных причин заболеваний и старения (сверхболезни) живого организма. Неблагоприятные мутации могут переходить от родителей к потомству, что приводит к возникновению наследственных (молекулярных) заболеваний. В настоящее время расшифрована химическая сущность сотен молекулярных заболеваний, однако они всё ещё остаются неизлечимыми. Надежды здесь связываются в первую очередь с коррекцией и активацией естественной защитной (иммунной) системы человека, а также с генной инженерией.

16.2.4. Хемогеномика. Типы взаимодействий ПЛВ с ДНК

Хемогеномика. В 1980-х годах возникла наука фармакогенетика - часть фармакологии, изучающая зависимость лечебных и токсических эффектов одного и того же лекарственного вещества не только от возраста и характера больных, но и от их генетических особенностей и, в частности, от их пола и этнической принадлежности. Например, приём арабами кодеина не устраняет боли, т.к. это пролекарство в их организмах быстрее метаболизируется до неактивных метаболитов, чем гидролизуется до обезболивающего агента морфина. Из-за сложности индивидуальных генетических особенностей каждого пациента лекарства помогают лишь в половине случаев. В связи с полной расшифровкой человеческого генома в 2001 году фармакогенетика перерастает в фармакогеномику. Геномная паспортизация каждого человека позволит делать предварительный (перед назначением ЛВ) генетический анализ пациента для более точного выбора ЛВ.

Параллельно на стыке фармакологии, химии и информатики (науке о поиске, обработке, хранении и предоставлении надёжных информационных данных) возникла ещё одна наука – хемогеномика. Она изучает влияние любых химических веществ, а также потенциальных ЛВ и мишень-специфичных веществ на функции генов. Предсказательная хемогеномика опирается на: 1) библиотеки химических веществ; 2) библиотеки генов и генов-биомишеней; 3) сведения по экспериментальному скринингу множества химических веществ на множестве генов-биомишенией, включая библиотеку веществ с известной фармакокинетикой (данные по АРМЭТ). При этом предполагается, что структурно подобные вещества (СПВ) связываются с одними и теми же генами-мишенями и, следовательно, будут иметь подобный профиль биоактивности. А биомишени, взаимодействующие с такими СПВ, имеют аналогичные активные центры.

Типы взаимодействий ПЛВ с ДНК. На рис. 16.5 изображены три типа обратимого взаимодействия ПЛВ с ДНК. Внешний сахарофосфатный тяж ДНК содержит отрицательно заряженные группы фосфата. С ними могут взаимодействовать положительно заряженные или сильно поляризованные группы ПЛВ (рис.10.5.а):

Рис. 16.5. Структура ДНК и три типа взаимодействия ПЛВ (1-3) с ней. Л енты – сахарофосфатные связи, образующие тяж; вертикальные линии между тяжами обозначают пары аденин-тимин (А-Т) и цитозин-гуанин (С-G), азотистые основания в которых связаны Н-связями. а) внешнее электростатичекое взаимодействие между ДНК и ПЛВ 1; б) связь-укладка ПЛВ 2 по канавке-жёлобу; в) интеркаляция лиганда ПЛВ 3.

В больших жёлобах ДНК могут с ней связываться протеины, а в малых – небольшие по размеру ПЛВ 2 типа противораковых ЛВ цисплатина и карбоплатина (за счёт электростатических сил, Н-связей, стерического соответствия, вытеснения молекул воды гидрофобными силами). При этом не происходит раскручивания или удлинения двойной спирали. Так в случае двухзаряженного терминально нетропсина (4) его комплекс с ДНК значительно стабилизируется электростатическими взаимодействиями с ней, но малая канавка в ДНК расширяется всего на два ангстрема, а угол спирали в АЦ изменяется на восемь градусов.

NH₂--…..

ЛВ нетропсин

В дизайне новых противораковых ПЛВ такого линейного типа (полиамидного) следует учесть полезность введения в их молекулы концевых положительных зарядов или сильно поляризованных группировок атомов.

Для дизайна взаимодействия 3-го типа, а именно, интеркаляции ПЛВ стэкингом перпендикулярно оси двойной спирали ДНК, надо создавать плоские, преимущественно ароматические или гетероароматические молекулы ПЛВ, способные к образованию Н-связей и, что важнее, комплексов с переносом заряда. При интеркаляции расстояние между парами комплементарных оснований А-Т и С-G значительно увеличивается, что нарушает структуру тяжа, размеры спирали и передачу информации на РНК. При этом интеркалятор входит не между каждыми двумя парами оснований, а через один интервал (например, в случае последовательности из четырёх пар он входит между 1-й и 2-й и между 3-й и 4-й парами, но не между 2-й и 3-й). Этот принцип «отрицательной кооперативности» или «исключения соседа» трактует конформационное «прижатие» двух соседних пар оснований друг к другу и уменьшение за счёт этого расстояния между ними, что затрудняет вход второй молекулы интеркалятора к соседу. Н-Связи при этом не разрушаются, но нарушается регулярность спиральной структуры. На принципе интеркаляции был осуществлён дизайн четвертичных солей (49а, б), обладающих трипаноцидными свойствами. Димидий (49а) и этидий (49б, вместо группы NMe введена биоизостеричная N-этильная группа) - эффективные средства для лечения трипаносомозов. Это болезни, вызываемые паразитическими микроорганизмами (трипаносомами), переносчиками которых являются муха це-це (вызывает африканскую " сонную болезнь") и клоп триатомид (южноамериканская болезнь чага).

Кватернизация пиридинового атома азота в соединении (52) значительно повышает биоактивность препарата.

В середине 1980-х годов был предложен оригинальный способ использования природного фурокумарина - 8-метоксипсоралена (48), встречающегося в плодах инжира и некоторых овощах, - для лечения одной из разновидностей рака крови (Т-клеточной лимфомы). Этот метод, названный фотофорезом, основан на интеркаляции кумарина (48) в ДНК Т-лимфоцитов и последующем фотооблучении образующегося при этом комплекса (рис. 16.6):

Рис. 16.6. Схема взаимодействия интеркаляторной молекулы метоксипсоралена (48) с основаниями ДНК при фотовозбуждении

При фотовозбуждении подобного комплекса УФ-светом определенной длины волны двойная связь С₅=С₆ тиминового фрагмента ДНК раскрывается и взаимодействует с двойной связью при С₅=С₆ фуранового фрагмента интеркалятора (48), а тимин соседней пары оснований реагирует аналогичным образом с двойной связью при С₃=С₄ пиранового фрагмента той же молекулы интеркалятора (48). Происходит таким образом прочная ковалентная сшивка двух цепей ДНК раковой клетки, что предотвращает репликацию ДНК и, следовательно, останавливает размножение и рост " бессмертных" раковых Т-лимфоцитов.

В заключении раздела отметим, что на 2010 год создано «химическое пространство» синтезированных органических соединений, включающее 40-50 миллионов индивидуальных структур, а изучено в качестве потенциальных мишеней более тысячи генов и более трёх тысяч белков человека. На этой основе за «постгеномное» десятилетие получены ЛВ для лечения ряда наследственных заболеваний и некоторых видов рака, индуцирующих специфические дефекты в геноме. В целом, пока польза для медицины оказалась не большой.

ЛЕКЦИЯ 17 Проблема выработки резистентности к ЛВ. Дизайн ЛВ с пролонгированным эффективным действием

17.1. Механизмы выработки резистентности к ЛВ и дизайн новых ЛВ для борьбы с подобной устойчивостью

Полвека назад считали, что с инфекционными заболеваниями покончено. Но оказалось, что уже в те времена половина штаммов золотистого стафилококка была устойчива к пенициллину, а к концу прошлого века подобная цифра возросла до 90%. Как это случилось? Дело в том, что бактерии быстро размножаются, и если после их обработки данным антибактериальным средством остаётся в живых 1-2 бактерии из миллиона, то вскоре из выживших экземпляров возникает новый бактериальный штамм, уже устойчивый к этому ЛВ. Каковы механизмы выживания и адаптации микроорганизмов? Их можно разделить на мембрано-клеточные и внутриклеточные молекулярные уровни (пути) выработки устойчивости патогенных микроорганизмов к широко используемым ЛВ.

1). Уровень иммунной транспортной системы. Прежде всего патогенный микроорганизм включает свою внешнюю иммунную защиту клетки от атаки ЛВ. Так, на близких подступах ЛВ к своей биомишени, находящейся в клеточной мембране или внутри клетки, его встречают специальные транспортные белки-насосы (типа антител). Они распознают чужеродное вещество, захватывают его кооперативно действующими слабыми связями и быстро, чтобы ЛВ не успело оказать на микроорганизм токсического действия, и транспортируют его от чувствительной биомишени в межклеточное пространство, выводя его без метаболических (биохимических) событий. Патогенная бактерия при этом вырабатывает приёмы ускорения синтеза транспортных белков.

2). Уровень иммунной окислительной системы. В аналогичном случае атаки лекарством бактерия вырабатывает приёмы активизации (резко увеличивает концентрацию) другой защитной системы – семейства цитохромов Р 450, которые начинают быстрее окислять ксенобиотик. Подобное метаболическое событие быстро превращает ЛВ в неактивное соединение, легко удаляемое от биомишени или из клетки.

3). Внешний уровень мембранной защиты. После распознавания клеткой атакующего ЛВ-токсиканта, несущего заряд или сильный диполь, организм может перестроить электростатически внешнюю сторону клеточной мембраны. В этом случае на том участке мембраны, к которому приближается ЛВ, формируется заряд противоположного знака таким образом, чтобы отталкивать ЛВ от АЦ мембраны рис.17.1).

Рис.17.1. Формирование на внешнем участке клеточной мембраны заряда, противоположного заряду ЛВ.

4). Если биомишенью для ЛВ-ингибитора является конкретный фермент (например β -лактамаза для пенициллинов), то бактерия вырабатывает приём перепроизводства этого фермента, восполняя его потери от действия лекарственной дозы («умная бактерия знает принцип Ле Шателье»).

5). Выработка самозащиты патогеном методом точечной мутации АКО в активном центре биомишени. Это приводит к к уменьшению силы связывания ЛВ с биомишенью. Например, антибиотик триметоприм (1) ингибирует дигидрофолатредуктазу (ДФР) бактерии. Но он не активен в отношении этого фермента, если в его АЦ произошла мутация за счёт замены всего одной АКО.

…… (1) антибиотик

6). Выработка патогеном способности переключать биосинтез нужного метаболита с обычного пути на другой путь, т.е. с помощью другого фермента.

7).Способность бактерии к защитному перепроизводству своего природного субстрата для фермента, который является биомишенью данного ЛВ-ингибитора. Патоген, «зная» закон действия масс, пытается таким образом вытеснить из АЦ конкурентный ЛВ-антагонист-интоксикант. Полагают, что это случай, когда эндоконцентрацию ди- и тетрагидрофолиевой кислоты бактерия резко повышает, вытесняя стрептоцидный ЛП из активной зоны. С этой целью она активирует соответствующий фермент.

8). Развитие устойчивости у бактерии благодаря индуцированию ею генов, которые контролируют биосинтез новых ферментов, метаболизирующих ЛВ ацетилированием, аденилированием и фосфорилированием с потерей производными антибиотических свойств. Пример с биосинтезом β -пенициллиназ в борьбе с пенициллинами или новых ферментов в борьбе с неомицинами – аминогликозидными антибиотиками.

9). Выработка устойчивости прекращением бактерией или раковой клеткой биосинтеза того эндофермента, который превращал проЛВ в истинное ЛВ. Это наблюдалось в случае меркаптопурина (17) в истинное ЛВ - его гликозид (20), эффективный для лечения лейкемии.

6-Тиопурины (17-19) (изображены их 9Н-таутомеры) являются эффективными средствами лечения лейкозов, ревматических и легочных заболеваний. Они также используются при трансплантации органов в качестве иммуносупрессантов. При лечении острых лейкозов тиопурины участвуют в метаболизме нативных пуринов, тормозя их биосинтез в опухолевых клетках.

17.2. Ответы химика-синтетика и фармаколога по дизайну новых ЛВ для борьбы с

проявлением устойчивости патогенных микроорганизмов к классическим ЛВ

17.2.1. Химические и комбинированные способы пролонгирования действия ЛВ

Рассмотрим некоторые современные приемы по пролонгированию действия лекарств, что чрезвычайно важно как с точки зрения медицинской (уменьшение вводимых доз и снижение риска нежелательных побочных эффектов и токсичности, увеличение эффективности лечения), так и с точки зрения экономической (удешевление курса лечения). Обычно лекарственное средство состоит из собственно ЛВ (активное начало) и компонентов лекарственной формы, используемых для удобства введения препарата в организм. Поскольку большинство ЛВ быстро подвергается метаболизму и до биомишени порой достигает лишь десятая доля введенного препарата, постоянно ведутся работы по созданию таких лекарственных форм, которые обеспечивали бы длительную и равномерную подачу ЛВ в кровоток и точную их доставку к больному органу. (Известно, что лечебный эффект низкомолекулярных веществ после однократного приема сохраняется в среднем лишь от 3 до 6 часов).

Чтобы снизить эффект выработки патогенными микроорганизмами устойчивости к широко используемым в медицинской практики ЛВ прибегают к дизайну комбинированных препаратов. С этой целью создаются мультилекарственные средства, которые состоят из нескольких ЛВ (2-5), разных по структуре и по функциям. В этом случае вероятность мутаций и переключений путей в защитных системах патогена резко уменьшается, и он теряет способность к нормальной пролиферации (размножению клеток). Рассмотрим несколько общих путей дизайна комбинированных препаратов пролонгированного терапевтического действия:

1) Если патогенный организм способен ускорять биосинтез защитных транспортных белков, начинающих очень быстро удалять из активной зоны опасные для него ЛВ, то пролонгирование действия ЛВ заключается единственно в дизайне композитных мультиЛВ, которые включают новые ЛВ-ингибиторы таких белков. Сам ингибитор не обладает в данном случае терапевтическим эффектом.

2) При выработке патогенном способности резко активизировать свою защитную метаболическую систему цитохромов Р 450 при дизайне ЛП пролонгированного действия к основному ЛВ добавляют новый агент - ингибитор иммунных цитохромов. В таком композитном препарате ингибитор не имеет терапевтического эффекта, но поддерживает во времени таковой основного ЛВ.

3) В случае гибкой электростатической перестройки данным патогеном защитной клеточной мембраны прибегают к дизайну таких ПЛВ, которые не имеют зарядов, или создают комбинированные препараты из нескольких ЛВ разного типа. Примером может служить композитное средство для борьбы с туберкулёзом, состоящее из двух ЛВ – изониазида и рифампицина.

4) В случае выработки бактерией приёма перепроизводства эндофермента, ингибируемого ЛВ, стоит задача по дизайну ЛП, который включает не только целевой ингибитор этого фермента, но и новое ЛВ, действие которого направлено уже на торможение самого биосинтеза указанной биомишени.

5) При выработке точечной мутации в цепи АКО фермента или вируса необходим дизайн новых ЛВ, которые были бы структурно более близки к природным субстратам данной биомишени. Дело в том, что образовавшийся мутированный белок не будет катализировать как природный субстрат для биосинтеза нужного метаболита, так и вновь сконструированное ЛВ – аналог природного субстрата (принцип экзосубстрата). Например, к ламивудину (4) быстро вырабатывается устойчивость у ВИЧ-1 вируса, т.к. этот вирус мутирует за счёт замены валина 184 на метионин 184. Но в комбинации с AZT (1а) их антивирусное действие пролонгируется, т.к. ЛВ (1а) легко ингибирует этот мутированный псевдовирус, который принимает новое ЛВ за свой эндосубстрат.

В связи с важностью борьбы со СПИДом остановимся несколько подробнее на этой проблеме. Эта болезнь была открыта в США в начале 1980-х годов и была названа синдромом приобретенного иммунодифицита (СПИД; по английски AIDS - acquired immunodeficiency syndrom). В 2006 году число инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) во всем мире по разным данным достигло от 30 до 50 млн человек. К настоящему времени СПИД приобрел пандемический характер и причисляется к «болезням XXI-го века». Любой вирус (варион) состоит из нуклеиновой кислоты (НК), защищаемой капсидой (цилиндрической или сферической оболочкой белкового типа, иногда с включением липидов и сахаров). Капсида выполняет также функцию взаимодействия с клетками чужого организма, способствуя проникновению вирусной НК внутрь клетки-хозяина и запуску там синтеза новых вирусных молекул. В случае ВИЧ сложность заключается в том, что в чужом организме он встраивается в клетки самой иммунной системы (в лейкоциты, фагоциты, лимфоциты), призванной бороться с патогенными микроорганизмами. И как только зараженный организм включает в действие защитную иммунную систему, то вместе с размножением собственных иммунных клеток начинается бурный рост числа ВИЧ и клетка-хозяин теряет генетический контроль над биопроцессами. Сопротивляемость организма таким образом слабеет и у больных СПИДом возрастает возможность заражения другими инфекциями - туберкулезом, пневмонией, лейкозами и т.д.

К настоящему времени для лечения от СПИДа применяют более 20 синтетических ЛВ, однако все они только понижают концентрацию вируса. Более того, этот вирус очень быстро эволюционирует, давая уже за один репродуктивный цикл одну мутацию. Возникающая у разновидностей ВИЧ резистентность приводит к необходимости использовать композиции (" коктейли") из двух-трех ЛВ. Это удорожает курс лечения Следует отметить, что все известные ЛВ токсичны и поэтому длительность курса лечения не может пока превышать 2-3-х лет. Вместе с тем после прекращения приема ЛВ концентрация ВИЧ снова быстро возрастает и через некоторое время лечение необходимо возобновлять. Точками воздействия (биомишенями) лекарственных веществ на ВИЧ могут быт: капсида (ее разрушение), нуклеиновая кислота (ее мутация, ингибирование или разрыв) и, наконец, ферменты, которые участвуют в репликации НК. Некоторые синтетические ЛВ (1-4, см. выше) против СПИДа имеют нуклеозидную или близкую к ней природу и считаются антиметаболитами, могущими " спутать карты" вирусной НК, встраиваясь в нее и останавливая ее дальнейший рост в связи с отсутствием групп ОН в рибозильном или аналогичном ему фраменте (группа нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы). Установлено, что эти препараты в организме фосфорилируются клеточными ферментами до 5’-трифосфатов и в этой форме являются конкурентными ингибиторами обратной транскриптазы ВИЧ (ОТ ВИЧ), которая катализирует транскрипцию одноцепочечной вирусной РНК в двухцепочечную ДНК. Являясь пролекарствами, нуклеозидные антиспидные препараты воздействуют на ферментную биомишень и оказываются терминаторами роста цепи вирусной ДНК, что приводит, таким образом, к остановке размножения ВИЧ. Замечено также, что указанные 5’-трифосфаты могут ингибировать ДНК-полимеразы клетки-хозяина и давать значительные токсические эффекты. При длительном использовании препаратов появляются резистентные к ним штаммы ВИЧ (как уже отмечалось выше на примере ламивудина 4), в которых репликация на уровне НК уже не нарушается. Установлено, что длительное использование и самого AZT (1а) вызывает мутации в активном центре ОТ ВИЧ в кодонах Asр. 67 (он переходит в кодон Asn), Lys 70 (мутирует в Arg) и Thr 215 (дает кодон Tyr). Таким образом, мутированная ОТ ВИЧ уже не подвержена ингибированию азидовудином (1а).

6) При выявлении способности у патогена использовать разные ферменты для биосинтеза одного и того же метаболита конструируют новое вещество, которое, не обладая лечебным действием, в комбинации со старым ЛВ потенцирует его терапевтический эффект (явление синэргизма).

7) При активизации фермента биосинтеза бактерией избыточного субстрата, необходимого ей для вытеснения субстратом ксенобиотика-ЛВ из активной зоны, химик конструирует новое ЛВ-ингибитор этого фермента (пример с фолятами).

8) При выработке бактерией новых ферментов для быстрой дезактивации ЛВ метаболическими реакциями ацетилирования, фосфорилированияи т.п., подобную устойчивость пытаются преодолеть дизайном новых ЛВ, ингибирующих эти неоферменты, или конструированием ЛВ, в которых присутствуют мало гидроксильных и аминогрупп, заменённых на соответствующие биоизостерные группировки или атомы (например на карбонильный кислород).

9) В случае приобретения устойчивости к ЛВ за счёт прекращения биосинтеза фермента, который метаболизировал проЛВ в истинное ЛВ, создают комбинированные ЛП и/или осуществляют дизайн новых ЛВ по принципу антиметаболитов и их химической модификации. Серьёзной проблемой в хемотерапии онкологии становятся естественные или приобретённые резистентности раковых клеток в отношении практически всех используемых в настоящее время противоопухолевых препаратов (их рынок насчитывает около 60 препаратов, из которых 15 применяют широко; их продажа в 2007 г. оценивалась в 55 млрд. долларов). Более того, обнаруживается и так называемая мультирезистентность, т.е. сопротивляемость сразу к нескольким противораковым ЛВ. Подобная резистентность вырабатывается защитной системой больной клетки как минимум на трёх уровнях: 1) в системе транспорта ЛВ, где подключаются ЛВ-выводящие белки типа (Pgp1 (P-гликопротеины или MDR1), мультирезистентный белок (MRP1) и ещё один белок-насос, который вырабатывается специфически при раке молочной железы (BCRP1); все эти белки (к настоящему времени их открыто более 50) служат насосами, выводящими из клетки различные ЛВ, как, например, метотрексат и тетрациклины, снижая их концентрацию ниже терапевтического уровня; 2) в системе апоптоза (белок р53 и другие); 3) в системе детоксикации ксенобиотиков (цитохромные оксидазы Р450) и 4)на уровне репарации повреждений ДНК. Целенаправленный поиск селективных противораковых ЛВ в настоящее время ориентируется именно на эти 4 направления. Остановимся подробнее на одном из них.

Гликобелок Pgp1 состоит из 1280 аминокислот. Он является мембранным белком и содержит 12 трансмембранных участков, разделённых на две кассеты, которые соединены линкером из 60 аминокислот. Кроме транспортных функций в отношении чужеродных ЛВ он играет также антиапоптозную роль. Используя энергию АТФ, этот белок участвует в выбросе ЛВ из клетки через мембрану против градиента концентрации ЛВ. При связывании и гидролизе двух молекул нуклеотида АТФ происходит изменение конформации трансмембранных сегментов белка путем вращения a-спиральных участков, что уменьшает сродство гидрофобного ЛВ, и оно выбрасывается из клетки через образовавшийся при подобных переупаковках водные центральные поры в липидном бислое плазменной мембраны.

Основной задачей химиков является синтез специфических ингибиторов этого белка, которые должны действовать на его участки, взаимодействующие с ЛВ и АТФ. Уже найдены некоторые химические модуляторы подобной резистентности (например, циклоспорин А, тамоксифен, резерпин, ряд дигидропиридинов и др.), которые значительно улучшили фармакокинетику и увеличили эффективность ряда известных цитотоксичных противораковых средств. Другой биомишенью разрабатываемых мембраноактивных ЛВ может быть сама мембрана, структуру которой необходимо изменить с целью ослабления её связи с транспортным белком. Конструируются также ЛВ, которые не будут взаимодействовать с гликопротеином.

Антирезистентные потенциаторы цитотоксичности противораковых препаратов (ингибиторы гликопротеина (PgP1)

В заключении этого раздела отметим одно из новых направлений по химическому дизайну ЛВ пролонгированного действия. Недавно было выделено несколько небольших природных пептидов (из кожи древесных лягушек, ганглий улиток, яда пауков), которые содержат одну или две D-аминокислоты. Было подтверждено, что D-форма аминокислотного остатка в такого рода пептидах резко увеличивает их устойчивость к гидролитическому действию экзо- и эндопротеаз. Этот факт все более учитывается в настоящее время при создании олигопептидных ЛВ с большим временем биодействия.

17.2.2. Дизайн ЛВ с пролонгированным эффективным действием физико-химическими и физическими методами

К физико-химическим приемам пролонгирования действия ЛВ без изменения его структуры относятся различного рода химические «прививки» этого ЛВ к нейтральной полимерной основе (в виде координационных донорно-акцепторных или легко рвущихся ковалентных связей). Наиболее надежными физическими методами являются технологические способы пролонгирования, заключающиеся в создании лекарственных форм, которые резко замедляют выделение ЛВ в организме – матричных таблеток, микрокапсул, микродраже и др. В матричных таблетках для перорального приема ЛВ в качестве матриц используют как набухающие, так и инертные полимерные материалы: камедь; агар; модифицированные целлюлозы: этил-, полиоксиэтил-, метилоксипропил- и гидроксипропил-метилцеллюлозы; поливинилацетат; поливинилпирролидон; полиэтиленгликоль и др. В этих материалах ЛВ равномерно распределено и медленно выводится в организм. В целом введение ЛВ на полимере-носителе улучшает фармакокинетические и фармакодинамические свойства препарата, значительно пролонгируя его действие и позволяя контролировать его подачу в организм благодаря замедленной диффузии лекарства из места введения.

Создаются биологически активные полимеры, в котором фармакофором служит ЛВ «привитое» слабой ковалентной или координационной донорно-акцепторной связями. Такие системы имеют высокие периоды полувыведения ЛВ из организма. Степень пролонгирования их действия и уровень биоактивности зависят от скорости высвобождения ЛВ – гидролиза указанных связей ЛВ с носителем – полимерной матрицей. Ведутся работы по созданию водорастворимых нетоксичных сополимеров N-винилпирролидона (1), например, с аллиламином (2) или с акриловой кислотой (3). Наличие в полученных таким образом сополимерах (4) и (6) свободной амино- или карбоксильной группы позволяет затем синтезировать полимеры (5) и (7), связанные с ЛВ ионной связью (полимер 7) или ковалентной азометиновой (полимер 5), или сложноэфирной амидной и другими связями:

Подобные системы (5, 7) используют для получения антибактериальных и гемостатических (для остановки раневых и операционных кровотечений) средств пролонгированного действия.

Введение ЛВ в полимере-носителе улучшает АРМЭТ- свойства препарата, значительно пролонгируя его действие и позволяя контролировать его подачу в организм благодаря замедленной диффузии лекарства из места введения. В накожных терапевтических системах (аппликаторах) используют замедленную диффузию ЛВ из раствора, расположенного между наружной непроницаемой мембраной и внутренней, медленно проницаемой микропористой мембраной, изготовленной из эфиров целлюлозы, декстринов или полипропилена. Аппликаторы на основе пропилена, например, применяются для длительной подачи противорвотного, успокаивающего и противоукачивающего средства скополамина (8) при морской или воздушной болезни:

На основе растворов тринитроглицерина (9) в сополимере 2-гидроксиэтановой и 2-гидроксипропановой кислот получен аппликатор " тринитролонг", прикрепляемый к десне и действующий как средство от стенокардии уже в течение четырех часов. Подобные макромолекулярные системы с растворенными (или суспендированными) в них ЛВ начинают широко применяться и в гинекологической и стоматологической практике. Например, стероидный контрацептив прогестерон (природный гормон, 10) в твердом биосовместимом полидиметилсилоксановом каучуке {HO-(-SMe₂-O-)_n-H] помещают в полости организма (прикрепляется к матке), что обеспечивает в течение года предупреждение нежелательной беременности. Поскольку этот гормон очень быстро разлагается при пероральном приеме, ранее использовались его более стабильные, но и более токсичные гидроксипроизводные.

Изучаются возможности доставки ЛВ в больные органы в виде биосовместимых полимерных композитов, способных выделять из себя ЛВ под действием тепла. Например, гидрогели (или растворы) ЛВ (12) в теплочувствительном полидиэтилакриламиде (11) при нагревании низкоэнергетическим ультразвуком выделяют ЛВ из полимерного материала в результате его резкого уменьшения в объеме вследствие структурно-фазовых переходов:

Тепловой эффект в этом случае является основным фактором воздействия ультразвука на подобные транспортные носители ЛВ, названные триггер-материалами.

В настоящее время проводятся клинические исследования по использованию магнитоуправляемого транспорта ЛВ в биомишень. С этой целью создаются липосомы и микрокапсулы, содержащие ЛВ с ультрадисперсными металлическими частицами (ферромагнетиками: Fe, Co, Ni) или с коллоидными частицами ферримагнетиков – смесь оксидов Fe(III) с оксидами Ni, Co, Mn, Zn и др., называемых ферритами.

Подобные магнитоуправляемые носители ЛВ позволяют точно доставлять ЛВ к тромбу, опухоли или любому нужному месту в больном организме, воплощая таким образом в жизнь идею «магических пуль» и уменьшая побочное токсическое действие лекарства. В случае ферриколлоидов в качестве дисперсионной среды используют или водорастворимые полиэлектролиты или полимеры с присоединенными к ним лекарствами. В случае микрокапсул применяют дисперсию ЛВ и ферримагнетиков, например, в белковой (альбуминной) матрице. При этом применяют химическую сшивку или тепловую денатурацию.

Кроме белков в качестве среды-носителя изучают также декстраны (частично гидролизованные полисахариды с 1®6 связями бактериального происхождения), поливиниловый спирт, карбоксиметилцеллюлозу и фторуглероды. При ферментативном гидролизе крахмальной a-амилозы образуется фракция a-, β - и g-циклодекстринов (13). Самый доступный и дешевый из них β -декстрин используют для стабилизации ЛВ, продления их лечебного действия, уменьшения побочных эффектов и улучшения в целом фармакологического профиля ЛВ. Происходит это благодаря тому, что подобные циклодекстрины охотно образуют с ЛВ комплексы типа «гость» (ЛВ) - «хозяин» (циклодекстрин) (область супрамолекулярной химии) за счет гидрофобного взаимодействия. Циклодекстрины, олигомерные молекулы которых составлены из a-D-глюкозы с 1, 4-связями, образуют цилиндрическую емкость. С наружной части емкости располагаются гидроксильные (гидрофильные) группы, а внутри формируется гидрофобный карман, в который попадает в целом гидрофобное ЛВ, которое в виде комплекса с водорастворимым «хозяином» быстро доставляется кровотоком к биомишени:

Определенную перспективу имеют также липосомальные формы ЛВ. Липосомальные везикулы имеют форму шарообразных частиц, в которые заключены ЛВ. Эти везикулы состоят из двухслойной гидрофобной мембраны, изготовленной из фосфолипидных молекул, которые биосовместимы с организмом. Использование таких липосомальных ЛВ улучшает целевую доставку ЛВ к биомишеням, снижает их терапевтические дозы и уровень побочных эффектов. Широкое применение липосомальной техники для пролонгирования действия ЛВ пока сдерживается химической и метаболической неустойчивостью фосфолипидов, их невысокой чистотой выделения из природных источников и высокой себестоимостью.